Emerald Kül Freze Gen İfade Analizi ( Agrilus planipennis) Kullanarak Kantitatif Real Time PCR

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kantitatif PCR kullanarak zümrüt dişbudak böceğinin dokularındaki ve gelişim evrelerindeki gen ekspresyonunu analiz etmektir. Bu işlem, larval dokuların diseksiyonu ve gelişim evrelerinin kategorizasyonu ile gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, dokulardan ve gelişim evrelerinden triol reajeni kullanılarak RNA ekstrakte edilir ve bu RNA, birinci zincir cDNA üretimi için kalıp olarak kullanılır; birinci zincir cDNA sentezinin ardından kantitatif RT-PCR uygulanır.

Döngü eşik değerlerinden elde edilen toplam değişim verilerine dayanarak, hedef genin çeşitli larva dokularında ve gelişim aşamalarında farklılaşan ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilir. Kantitatif R-T-P-C-R amplifikasyonları sonrası. Merhaba, ben Prakash Mi, Ohio State Üniversitesi Entomoloji Bölümü'ndeki bu laboratuvarın yürütücüsüyüm.

Laboratuvarım temel olarak emal, lash, burer ve ash etkileşimlerinin genomik veya moleküler yönlerine odaklanmaktadır. Emal, lash Burer veya EAB, Çin kökenli egzotik istilacı bir zararlıdır ve Kuzey Amerika genelindeki ash popülasyonlarının varlığını tehdit etmektedir. Bugün size, QPCR veya kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanarak EAP re'de gen ekspresyon analizi öğrenmek için bir protokol göstereceğiz.

Bu protokolde yer alacak laboratuvar üyeleri; val diseksiyonlarını gerçekleştirecek olan Swapna pri ou, ardından RNA izolasyonunu gösterecek olan bin Bandari ve son olarak QPC analizini inceleyecek olan Lauren Rivera Vega'dır. Ayrıca laboratuvarımızda kül ağacının gen ekspresyonunu incelemek için de bu prosedürü kullanmaktayız.

Hadi başlayalım. Bu prosedüre başlamadan önce, emerald ash B veya EAD larvalarını nemli doku kağıdına yerleştirin. Diseksiyonlar gerçekleştirilene kadar, diseksiyon boyunca tamponun soğuk kalmasını sağlamak için taze hazırlanmış 1x fosfat tamponlu salin veya PBS'yi buz üzerinde tutun.

Başlangıç olarak, EAB larvalarını ince diseksiyon iğneleriyle diseksiyon plakasına sabitleyin. Ardından diseksiyon plakasına soğuk 1x PBS ekleyin. İlk olarak, larvaların başlarını ince bir diseksiyon makasıyla kesin.

Ardından, saatçi pensi kullanarak larvaların son abdominal segmentini çıkarın. Kütikülü larva gövdesinden kaldırın, ardından bir makas kullanarak gövde boyunca bir kesi yapın. Bağırsakları yırtmamaya özen gösterin.

Kesi yapılırken, orta bağırsağı yağ cisimcikleri ve bağ dokusu gibi diğer dokulardan dikkatlice ayırın. Ardından, yağ cisimciği kontaminasyonu olmadığından emin olmak için dokuyu taze 1X PBS tamponu ile durulayın. Orta bağırsağı, 1,5 ml'lik bir mikro santrifüj tüpü içerisindeki 500 µL önceden soğutulmuş triol reaktife aktarın.

Ardından, yağ vücudu dokusunu pens yardımıyla izole edin ve 500 µL soğutulmuş triol reajenti içeren 1,5 ml'lik bir eppendorf tüpüne aktarın. Son olarak, yapışan tüm dokuları sıyırarak larva karkasından kütikül dokusunu izole edin. Bu işlemi yaparken doku bütünlüğüne zarar vermemeye özen gösterin.

İzole edilen kütikula dokusunu taze PBS tamponu ile durulayın ve 500 µL soğutulmuş triazol reaktifi içeren 1,5 mL'lik bir eppendorf tüpüne aktarın. İzole edilen yağ vücudu kütikula ve orta bağırsak dokuları, RNA ekstraksiyonuna kadar -80 °C'de saklanabilir. RNA ekstraksiyonu hazırlığı için, çeşitli EAB örneklerini gelişim evrelerine göre ayırın.

Bu aşamalar yıldızlarda, PrepU'da ve yetişkinlerde birinci, ikinci, üçüncü ve dördüncü aşamaları içerir. RNA ekstraksiyonuna başlamak için, önce plastik pestleler kullanarak dokuları 1.5 milliliter triol içeren tüplerde homojenize edin. Homojenizasyon sonrası, her örneğin toplam hacmini triol reaktifi ile one milliliter'e tamamlayın.

Gelişim aşamaları için, tüm hayvanı sıvı azot içerisinde havan ve eli ile homojenize edin. Ardından, homojenatın bir alikotunu bir mililitre triol içerisine ekleyin. Örnek tüplerini bir mililitre triol ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, kloroform eklemesinin hemen akabinde her tüpe 200 µL kloroform ekleyin. Tüpleri yaklaşık 15 saniye boyunca kuvvetlice çalkalayın. Ardından tüpleri oda sıcaklığında iki ila üç dakika daha inkübe edin.

Ardından, örnekleri 2 °C'de 15 dakika boyunca 12,000 GS'de santrifüjleyin. Santrifüj sonrası RNA, sulu fazda yer alacaktır. Sulu fazın hacmi 600 µL veya toplam triol hacminin %60'ı olmalıdır.

Sadece sulu fazı dikkatlice uzaklaştırın. Sulu fazın altındaki maddelerin varlığı, ekstrakte edilen RNA'nın kontaminasyonuna neden olacaktır. Ardından sulu fazı, uygun şekilde etiketlenmiş 1.5 milliliter einor tüpüne aktarın.

Sulu faz karışımından RNA'yı çöktürmek için her tüpe 0.5 milliliters izopropil alkol ekleyin. Örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından tüpleri iki degrees Celsius sıcaklıkta 10 dakika boyunca 12,000 Gs hızda santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, tüplerdeki S natin'i atın.

RNA, tüpün dibinde oluşan jel benzeri pelet içerisinde bulunmaktadır. Peleti %75 etanol ile yıkayın; her 1 mL karışım için en az 1 mL %75 etanol ekleyip vorteksleyerek karıştırın. Ardından tüpleri 2 °C'de beş dakika boyunca 7.500 G'de santrifüjleyin.

Tüplerdeki süpernatanı dökün. Tüpleri küçük masaüstü santrifüjde bir dakika daha santrifüjleyin. Kalan fazla süpernatanı dikkatli bir pipetleme işlemiyle tüpten uzaklaştırın.

Tüpü açık bırakın ve peletin beş ila 10 dakika boyunca havada kurumasını bekleyin. Peletin aşırı kurumamasına dikkat edin, çünkü bu durum hava kurutma sonrası çözünürlüğünü önemli ölçüde azaltacaktır. Peleti dietil perkarbonat veya DEPC ile işlem görmüş suda yeniden süspande edin.

Peleti yeniden süspande etmek için kullanılan su miktarı, peletin boyutuna bağlı olacaktır. Küçük bir pelet için 50 microliters, büyük bir pelet için ise 100 microliters dep sea treated water kullanın. Pipet ucunu birkaç kez yukarı ve aşağı hareket ettirerek peletin dep sea treated water içinde tamamen çözünmesini sağlayın.

Pelet çözündükten sonra, örneği 10 dakika boyunca 55 °C'de bekletin. Ardından, her bir RNA örneğinin konsantrasyonunu NanoDrop spektrofotometre kullanarak ölçün. Son olarak, ilgili RNA örnekleri için RT-PCR'a yönelik Invitrogen SuperScript birinci zincir sentez sistemini kullanarak birinci zincir cDNA sentezini gerçekleştirin.

Bu prosedür, bu protokolün yazılı kısmında bulunabilir. Kantitatif gerçek zamanlı PCR veya Q-R-T-P-C-R'ye başlamak için, her bir primerin erime sıcaklığını 60 °C ve ürün boyutunu yaklaşık 100 baz çifti olacak şekilde tasarlayın. Bu deney için ilgi odağı olan gen olarak AP par one kullanılmıştır.

Verilerin daha sonraki analizi ve normalizasyonu için bir referans gene veya internal kontrole ihtiyaç duyulur. Burada, referans gen olarak ribozomal protein a P RRP one kullanılır. Ardından, her kuyucuk için örnek adının belirtildiği bir şablon ve QR tpcr plakası tasarlayın.

Her gen için standartların ve örnek başına en az iki teknik tekrarın dahil edildiğinden emin olun. Ardından QRT PCR cihazını açın ve CFX 96 cihazı için plakayı hazırlamak üzere döngü parametrelerini girin. İlk olarak, her kuyucuk için her geni ayrı bir tüpte olacak şekilde master mix'i hazırlayın.

Master mix; iki µL nükleazdan arındırılmış su, dört µL 2.5 x cyber green, bir µL ileri primer ve bir µL geri primerden oluşarak toplam sekiz µL hacme ulaşır. Daha önce tasarlanan şablona göre, her kuyucuğa iki µL cDNA ekleyin. Ardından, her kuyucuğa sekiz µL master mix ekleyerek reaksiyon başına toplam 10 µL hacim elde edin; örneğin iyi karıştığından emin olmak için pipetle yukarı-aşağı çekme işlemi yapın.

Uçta sıvı kalmadığından emin olun. Çapraz kontaminasyonu önlemek için her örnekte yeni bir uç kullanın. Tüm plaka hazırlandıktan sonra, plakayı optik bantla kapatın.

Yağ varlığı okumayı etkileyebileceği için banda dokunmaktan kaçının. Ardından, kuyucuklardaki tüm ürünlerin santrifüj sonrası plakanın tabanında olduğundan emin olmak için plakayı 500 RPM'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Plakanın tabanında buz veya su olmadığından emin olun.

Son olarak, plakayı QR TPCR cihazına yerleştirin ve larva EAB için temsilci sonuçlar içeren PCR programını çalıştırın. Diseksiyon ve QR TPCR burada gösterilmiştir. Larva EAB diseksiyonu, larva EAB'nin ortasında orta bağırsağı ortaya çıkarmalıdır.

Larva EAB'nin orta bağırsağı burada gösterildiği gibi izole edilir, ortalama bağıl ekspresyon değerleri veya RAV'lar. Para trofin geni AP par one için kütikül, orta bağırsak ve yağ cisimcikleri dahil olmak üzere farklı larva dokuları burada gösterilmiştir. EAB'ye özgü ribozomal protein ARP one, ilgilenilen gen için elde edilen verilerin normalizasyonunda internal kontrol olarak kullanılmıştır.

Farklı larva dokuları için AP AP par one'nin göreceli kat değişimi çıkarılmıştır. Kütikül dokusu en düşük ekspresyonu göstermiş ve bu nedenle, birinci, ikinci, üçüncü ve dördüncü larva evreleri dahil olmak üzere EAB'nin farklı gelişim aşamalarındaki AP Perry için kalibratör örnek ortalama RV'leri olarak alınmıştır.

PrepU ve yetişkin örnekleri, verileri normalize etmek için dahili kontrol olarak aprp one kullanılarak belirlenmiştir. Çeşitli gelişim aşamaları için AP Perry one'ın bağıl kat değişimi tespit edilmiştir. Burada PrepU örneği en düşük mRNA seviyesini göstermiş ve bu nedenle kalibratör olarak kabul edilmiştir.

Lateral diseksiyonların nasıl yapılacağını ve ardından, bu prosedür sırasında kantitatif R-T-P-C-R kullanılarak Emeral ra'nın yan kısımları ile çeşitli gelişim aşamalarının gen ekspresyon analizlerinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk. Doku örneklerinde çapraz kontaminasyona neden olmamak için diseksiyon sırasında dikkatli olmalısınız. Ayrıca, ilgili örneklerin ilgili PCR kuyucuklarına pipetlenmesi için Q-R-T-P-C-R işlemi sırasında özen gösterilmelidir.

Hepsi bu kadar. Videomuzu izlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.