Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Bu prosedürün genel amacı, çok sayıda fenotipin veya metabolik yolun altında yatan gen ekspresyon profillerini araştırmaktır. Bu işlem, öncelikle iki zıt nematod suşundan mRNA izole edilerek gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, SSI3 veya SFI yakalama dizilerini içeren cDNA sentezlemek ve bunları bir mikroarray ile hibridize etmektir.

Prosedürün üçüncü adımı, mikro diziyi S SI üç ve SCIFI floroforları içeren anti yakalama dizileri ile hibritlemektir. Prosedürün son adımı ise mikro dizinin taranması ve magic tool yazılımı gibi biyoinformatik araçlar kullanılarak verilerin analiz edilmesidir. Nihayetinde, araştırılan biyolojik fenomeni yöneten aday genler belirlenir ve gerçek zamanlı PCR gibi alternatif tekniklerle valide edilip miktarları ölçülebilir.

Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, damlatılan nükleotidlerin kullanıcı tarafından görülmemesi nedeniyle zorluk yaşarlar; bu durum, homojen bir hibridizasyon karışımının 23.000'den fazla benzersiz şekilde basılmış nükleotid üzerine üst üste getirilmesini zorlaştırır. Sağlıklı, senkronize nematodlardan RNA toplayarak başlayın. Öncelikle, nematodlar yıkanıp 15 mL'lik tüplere yeniden süspande edilir ve peletlenir; solucan peletleri 7 mL 0,1 M sodyum klorür ve 7 mL buz gibi soğuk, %60 ağırlık/hacim sükroz içerisinde yeniden süspande edilir.

Buz üzerinde 15 dakikalık inkübasyonun ardından, solucanlar tekrar pelletlenir. Artık bakteri içermeyen solucanlar yukarı yüzecek; bunlar toplanır, RNase'siz su ile yıkanır ve pelletlenir. Ardından, gevşekçe sıkışmış temiz pellet, maksimum hızda 30 saniye boyunca döndürülen bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır.

aspire edilip dört derece Celsius'ta, işleme hazır olana kadar 10 hacim RNA later içerisinde saklanmıştır. Toplam RNA örneklerini hazırlamak için, hazırlanan peletleri maksimum hızda santrifüjleyin, süpernatanı atın ve pelete bir tutam moleküler öğütme reçinesi ekleyin. Ardından, karışımı bir havan eli kullanarak sıvı azotla dondurun.

Donmuş solucan süspansiyonunu ince bir toz haline gelene kadar öğütün; öğütme işleminden sonra tozun soğuk kalmasını sağlamak için gerektiğinde sıvı azot ekleyin. Ekstraktı beş dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Beş dakika sonra, ekstraktı toplam 700 µL R-L-T-B-M-E ve 472 µL %100 ethanol ile karıştırın.

RNA artık, biyolojik örnek başına 60 µL izole RNA nihai hacmi elde edecek şekilde, ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılarak izole edilebilir. İşleme devam etmeden önce, DNAse I ile işlem yaptıktan sonra ticari bir RNA temizleme kiti kullanarak olası genomik DNA kontaminasyonunu giderin. Kit prosedürünü 60 µL hacme tamamlayarak sonuçlandırın.

Son olarak, RNA konsantrasyonunu belirleyin ve mikroarray hibridizasyonu öncesinde glyoxal örnek yükleme boyası ile işlem ve jel analizi yaparak RNA bütünlüğünü değerlendirin. Konvansiyonel yöntemler kullanılarak saflaştırılmış RNA, komplementer DNA'ya ters transkribe edilir; bu DNA, ticari olarak mevcut bir kit ile degrade olmuş şablondan saflaştırılır ve 60 µL hacme getirilir. Mikroarray hibridizasyonuna, mikroarray lamlarını sonike edilmiş somon spermi DNA'sı ile bloke ederek başlayın. Bir saat sonra, bloke edilmiş lamları çift distile su ile yıkayın ve santrifüjleyin.

Lamları, bir kim wipe ile desteklenmiş 50 mililitrelik konik tüpler içinde kurutun. Şimdi, iki x formamid bazlı bir hibridizasyon tamponu hazırlayın. Öncelikle, kristallerin tamamen çözünmesi için tamponu 10 dakika boyunca 55 °C'ye ısıtın.

Ardından 10, 000 gs'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Sonrasında, 25 µL CD NA ile 25 µL hibridizasyon tamponunu karıştırın ve karışımı hafifçe vura vura çalkalayın. Şimdi karışımı kısa süreli santrifüjleyin (quick spin) ve 80 °C'de 10 dakika inkübe edin.

İnkübasyon sonrası, lam yüzeyine temas etmeden tüm cDNA örneğini mikroarray lamı üzerine dikkatlice pipetleyin. Örneğin mikroarray lamı üzerine homojen şekilde yayılması için, bir şırınga iğnesi kullanarak üzerini kapatacak olan lameli yavaşça indirin; lamel tamamen inmeden önce tekrar yukarı çekin ve lamelin nazikçe yerine yerleşmesini sağlayarak iğne ile yeniden indirin.

Bu teknik hava kabarcıklarının oluşumunu minimize eder. Şimdi lamı yatay olarak 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin, lamın altına 50 mikrolitre çift distile su ekleyin ve 37 derece Celsius'ta gece boyunca inkübe olmaya bırakın. Ertesi gün, lam yıkandıktan kısa bir süre sonra ikinci bir hibridizasyon gerçekleştirilir.

SSC'de, ışığa duyarlı yakalama reaktifleri ve bir Antifa reaktifi içeren ikinci tampon çözelti, benzer bir teknikle birkaç kez uygulanır; bunu kısa bir inkübasyon, daha fazla yıkama ve kurutma işlemi takip eder. Ardından lam taranabilir. Görüntüler, açık kaynaklı magic tool içeren ücretsiz yazılım kullanılarak analiz edilebilir.

Proje sekmesinde, ifade profili oluşturma sekmesi altında yeni bir proje oluşturun ve kaydedin; görüntü çiftini yükle seçeneğini belirleyip kırmızı görüntü dosyasını kırmızı, yeşil görüntü dosyasını ise yeşil olarak seçin. Ardından, ifade profili oluşturma sekmesini seçin. Mikroarray görüntüsünü adreslemek ve ızgaraya bölmek için GCAT web sitesinden alınan bir C elegance gen listesi dosyasını yüklemek amacıyla gen listesini yükle seçeneğini belirleyin.

Build expression profile sekmesini seçin ve create edit grid seçeneğini oluşturun. Şimdi ızgarayı düzenleyin. Kurulum iletişim kutusunda ızgara sayısını 48, her bir ızgara için 22 satır ve 22 sütun olarak ayarlayın ve noktaları soldan sağa ve yukarıdan aşağıya numaralandırmayı seçin.

Kontrast değişim yüzdesini artırın ve tekil noktalar kolayca ayırt edilebilene kadar ızgara üzerinde yakınlaştırma yapın. Sol panelden sol üstteki noktayı seçip ardından önce sol üstteki noktanın merkezine, sonra sağ üstteki noktaya ve birinci ızgaradaki alt sıraya tıklayarak ızgaraları oluşturun. Bu ızgaralama işlemini, soldan sağa ve yukarıdan aşağıya doğru ilerleyerek 48 ızgaranın her biri için tekrarlayın.

Ardından, dosya sekmesini seçip "mevcut ızgarayı şunun olarak kaydet" seçeneğine tıklayarak kaydedin. Analizden ilgisiz lekeleri çıkarmak için tamamlandı sekmesini seçin. İfade profili oluştur sekmesini açın ve adresleme ızgara seçeneğinin altından leke işaretlemeyi seçin.

Şimdi, herhangi bir çizgi oluşmuş noktaları veya arka plan floresansını işaretleyin ve "save current flags" (mevcut işaretleri kaydet) seçeneğini belirleyerek kaydedin. "File" (dosya) sekmesi altında, işaretli dosyalar segmente edilmelidir. Son olarak, "expression" (ekspresyon) sekmesi altındaki "explore" (keşfet) seçeneğini belirleyerek, belirli bir faktör tarafından indüklenen veya baskılanan genleri analiz edin.

Keşif iletişim kutusunda, ince gen eşleştirme kriterlerini ayarlayın. İfade düzeyindeki iki katlık artış veya azalış sayısıdır. Yoğunluk x olarak bilinir ve X değeri ifade değişimi için kriterdir.

İndüklenen genler için maksimum değer X'ten büyük, baskılanan genler için ise minimum değer X'ten küçük olacak şekilde X girişi yapılır. Bu deneyde, bir boya değişimi (dye swap) kontrolü gerçekleştirilir; evre üç ve evre dört larvalarından elde edilen iki bağımsız toplam RNA izolasyonu, yeşil mutant ile kırmızı yabanıl tip veya kırmızı mutant ile yeşil yabanıl tip şeklinde hibritlenerek gen ekspresyon değişiklikleri doğrulanır. Aynı prosedür kullanılarak üç bağımsız toplam RNA izolasyonu yapın, ticari olarak mevcut bir kit ile cDNA sentezleyin ve her bir cDNA örneği için kontrol olarak üç housekeeping gen kullanarak üç tekrarlı gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin. Gösterim amacıyla, aşağıdaki sonuçlar VSM 1'de indüklenen gen ekspresyonunu incelemektedir.

Mikrodizilim analizi gerçekleştirilmeden önce, gelişmiş sinaptik özelliklerle karakterize edilen bir nematod suşu olan AK 1468 mutantlarından ekstrakte edilen RNA'nın kalitesi jel elektroforezi kullanılarak kontrol edilir. DNase I işlemi öncesi ve sonrasında iki sağlam ribozomal alt birimin varlığı, mikrodizilim için uygun bir RNA örneğine işaret eder; yabani tip cDNA kırmızıya, VSM 1 mutant cDNA ise yeşile etiketlenir. Mikrodizilim başına analiz edilen 48 ızgaradan birinde, her küçük kare basılmış tek bir oligonükleotidi temsil eder ve her dizilimde her bir benzersiz oligonükleotid temsil edilmektedir.

Dördüncü evre larvalardan izole edilen transkriptlerin mikroarray analizi, ana sperm proteinlerini veya MSP'leri kodlayan genlerin VSM one mutantlarında indüklendiğini gösterdiğinde, üçüncü evre larvaların mikroarray analizi de mutantta aynı gen ailesi içinde ekspresyon değişiklikleri olduğunu ortaya koymaktadır. Mikroarray'den elde edilen öngörülerin real-time PCR analizi ile test edilmesi, M ms P gen ailesinin bir üyesi olan MS P 32'nin VSM one mutantlarında indüklendiğini göstermektedir. Veriler, aynı RNA koleksiyonundan elde edilen real-time PCR'ın üç tekrarının ortalamasını temsil etmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, özellikle bilimsel topluluğun erişimine açık birçok açık kaynaklı biyoinformatik yazılım programı olduğu göz önünde bulundurulduğunda, genom çapındaki analizler için biyoinformatik araçların nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.