Canlı Hücrelerde Floresan Proteinleri ve Çift prob Optik Vurgulama Saf, Fotoçevrim

Aşağıdaki deneyin genel amacı, dört ayrı hücre popülasyonunu veya hücresel kompartımanı seçici olarak etiketlemek için çift prob optik vurgulama yöntemiyle floresan proteinler M orange ve andron kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle tüm yeşil floresanları kapatmak için hücrelerin düşük yoğunluklu 488 nanometre uyarım ışığı ile aydınlatılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda hücreler, m orange floresansını kırmızıya fotokonverte eden yüksek yoğunluklu 488 nanometre uyarım ışığına maruz bırakılır.

Ardından, çift floresan özelliğini aktif hale getirmek için hücreler 800 nanometre iki foton uyarımına maruz bırakılır. Yine, M Orange two ve drawn ppa ile çift prob optik işaretleme temelinde hücrelerin dört farklı kombinasyonda etiketlenmesinin mümkün olduğunu gösteren sonuçlar elde edilir. Bu prosedürün, hücre altı fraksiyonalizasyon gibi mevcut deneylere göre temel avantajı, canlı hücreler üzerinde gerçekleştirilmesidir.

Bu prosedür, insülin veziküllerinin neden sadece küçük bir kısmının salgılandığı gibi beta hücre biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedür beta hücre fonksiyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer sistemlere de uygulanabilir. Örneğin, kanser hücrelerinin in vivo takibi için kullanılabilir. Bir floresan protein damlacık örneği, su fazında bulunan bir floresan proteini içeren oktal su emülsiyonundan oluşur.

Bu emülsiyon, mikroskopi uygulamaları için bir mikroskop lamı ile 22 milimetrelik kare bir lam örtü camı arasına yerleştirilir. Bu prosedürün başlangıcında, mikroskop lamları ve örtü camları temizlenmeli ve hidrofobik bir ajanla kaplanmalıdır. Cam malzemeleri beş dakika boyunca asetonla yıkayarak temizleyin.

Yıkama işleminin ardından cam malzemeleri havada kurumaya bırakın. Ardından, aseton içerisinde %2'lik metil trimetoksisilan çözeltisi hazırlayın ve cam malzemeleri iki dakika boyunca bu çözeltiye daldırarak kaplayın. Kaplama işleminden sonra cam malzemeleri çözeltiden çıkarın ve kurumaya bırakın.

Ardından cam malzemeyi bir sprey şişesindeki %70 ethanol ile durulayın. Durulama işleminden sonra, cam malzemenin tekrar havada kurumasını bekleyin ve kalan tüm sıvıları uzaklaştırın. Basınçlı hava kullanılarak, kaplanmış cam malzemeler en az bir ay boyunca saklanabilir.

Cam malzemeler hazırlandıktan sonra, daha önce e coli'den his etiketli protein olarak saflaştırılmış floresan proteinler temin edin. Saflaştırılmış proteinin absorpsiyon spektrumunu ölçün. %0,1 sığır serum albümini içeren pH sekiz tris tamponlu salin çözeltisi ile yaklaşık 0,1 optik yoğunlukta bir stok dilüsyonu hazırlayın.

Ek olarak, 15 mililitrelik konik bir tüp içinde 1:1 oranında oktanol ve tris tamponlu salin çözeltisi karışımından 10 mililitre hazırlayın ve kuvvetlice karıştırın. Karıştırma işleminden sonra, faz ayrışması tamamlanana kadar karışımı bekletin. Emülsiyonu oluşturmak için üst faz olan oktanolden 45 µL ve floresan proteinden 5 µL alarak bir epidorf tüpe aktarın.

Emülsiyon oluşumunu başlatmak için tüpe birkaç kez hafifçe vurun, ardından tüpü bir sonikasyon banyosunda 30 saniye boyunca sonikasyona tabi tutun. Bu sırada, sonikasyon sonrası için kaplanmış bir mikroskop lamı ve lamelini hazır hale getirin. Emülsiyon tamamen bulanık görünmelidir.

Tüpteki emülsiyondan dört µL'yi hemen tüpün ortasından kaplamalı bir mikroskop lamı üzerine pipetleyin ve üzerini kaplamalı bir lamel ile kapatın. Emülsiyon, mikroskop lamı ile lamel arasında eşit şekilde yayılmalıdır. Örnek, birkaç dakika içinde stabil hale gelmelidir.

Aşağıdaki prosedür, konfokal lazer taramalı mikroskopta floresan protein fotokonversiyon deneyi kurulumu için genel bir stratejidir. Bu prosedür, hem saflaştırılmış proteinler hem de canlı hücreler için uygulanabilir. Bu deneyde, saflaştırılmış m orange two protein içeren bir damlacık örneği, fotokonversiyon deneyi için genel bir başlangıç noktası olarak kullanılmıştır.

Konfokal lazer tarama mikroskobunu şu şekilde kurun. 40 x 1.3 sayısal açıklıklı yağ daldırma objektif ve 512 x 512 piksel görüntü boyutu kullanın. Piksel bekleme süresini tarama başına altı mikrosaniye olarak ayarlayın, zoom değerini dörde getirin ve pinhole boyutunu 3 µm'lik bir Z çözünürlüğü ile eşleşecek şekilde artırın.

Başlangıç ve fotokonvertlenmiş floresansın yanı sıra bir fotokonversiyon kanalı için iki deteksiyon kanalı yapılandırın. Turuncu türleri 561 nanometre eksitasyon ışığı kullanarak gözlemleyin ve 570 ile 630 nanometre arasındaki floresansı toplayın. Fotokonvertlenmiş kırmızı türleri 633 nanometre eksitasyon ışığı kullanarak detekte edin ve 640 ile 700 nanometre arasındaki floresansı toplayın.

Fotokonversiyon kanalı için 488 nanometre lazer hattını seçin ve 490 ile 540 nanometre arasındaki floresans ışığını toplayın. Fotokonversiyon kanalı kesinlikle gerekli değildir ancak yardımcı olabilir. Deneye başlamak için, optimal görüntü kalitesi adına lazer gücünü ve detektör kazancını ayarlamak amacıyla detektör kanalını kullanarak başlangıç floresansını sürekli tarama ile görüntüleyin.

Ardından fotokonversiyon kanalını aktive edin ve düşük lazer gücünü seçin. Bir zaman atımlı (time-lapse) görüntüleme serisi başlatın ve başlangıç floresansında belirgin bir ağarma (bleaching) gözlemlenene kadar fotokonversiyon lazerini kademeli olarak artırın. Başlangıç floresansı yaklaşık %75 oranında ağarana kadar taramaya devam edin.

Ardından, foto-dönüşüm kanalını devre dışı bırakın ve foto-dönüştürülmüş floresans için tespit kanalını aktif hale getirin. Görüntülemeye, düşük lazer gücünde yüksek dedektör kazancı ile başlayın. Daha sonra, foto-dönüştürülmüş floresans tespit edilene kadar lazer gücünü kademeli olarak artırın.

Saptama yapıldıktan sonra, optimal görüntü kalitesi için lazer gücünü ve dedektör kazancını ayarlayın. Son olarak, fotokonversiyon için kullanılan lazer gücünü ve uygulama süresini optimize edin. Lazer gücünün artırılması, fotokonversiyon hızını artıracaktır.

Ancak, çok yüksek lazer gücü proteinin fotobeyazlamasına neden olacaktır. Optimal fotodönüşüm, lazer gücü ve süresi belirlendikten sonra, bu parametreler standart bir fotobeyazlama modülü veya fotobeyazlama sonrası floresans geri kazanımı modülü yapılandırmak için kullanılabilir. Ardından, M orange two'nun Redshift spektral özellikleri nedeniyle fotodönüşüm kanalına artık ihtiyaç kalmayacaktır.

Çift prob optik vurgulama için, PU olarak çizilen yeşil foto-anahtarlanabilir floresan proteinle kombinasyon halinde kullanılabilir. Çift prob optik vurgulamaya başlamak için, HeLa hücrelerini cam tabanlı mat tech kaplarında büyütün ve standart bir LIPOFECTAMINE 2000 transfeksiyonu kullanarak, görüntülemeden 24 saat önce hücreleri floresan proteinleri kodlayan plazmitlerle transfekte edin.

Canlı hücreleri bir konfokal lazer taramalı mikroskoba yerleştirin ve mikroskobu daha önce açıklandığı gibi M orange two foto-dönüşümü için ayarlayın. Ardından mikroskobu DPA foto-anahtarlama için yapılandırın. DPA, 488 nanometre ışıkla uyarılır ve floresansı M orange two foto-dönüşüm kanalı kullanılarak görüntülenir.

MPA görüntüleme için kullanılan lazer gücünü minimize ettiğinizden emin olun, çünkü aşırı lazer gücü mpa'nın inaktivasyonuna neden olacaktır. 800 nanometre iki foton uyarımı kullanarak MPA foto aktivasyonu için bir kanal ekleyin; ardından foto aktivasyon ve foto inaktivasyon OFA floresansı için gerekli olan lazer gücünü belirleyin.

Bu prosedürün en zor yanlarından biri, M orange'ı fotokonverte etmeden RPA'yı inaktive etmektir. Çünkü her iki olay da aynı dalga boyunda gerçekleşir. Bunu önlemek için, fotokonversiyonun dikkatle optimize edilmesi oldukça önemlidir.

Lazer gücü ve süresi M orange two'nun fotokonversiyonu nedeniyle dikkatli olunmalıdır. PU'nun inaktivasyonu, belirgin bir m orange two fotokonversiyonu olmadan PU'yu inaktive etmek için 488 nanometre ışık ile eksitasyon üzerine meydana gelir. M orange two fotokonversiyonu ve DPA foto anahtarlama parametreleri belirlendikten sonra daha düşük bir lazer gücü kullanın.

Çift problu optik vurgulama gerçekleştirilebilir. İlk olarak, düşük güçlü 488 nanometre eksitasyon ile tüm görüş alanındaki DPA floresansı inaktive edin. Ardından, bir ilgi alanı seçin ve yüksek güçlü 488 nanometre eksitasyon ile m orange two'yu dönüştürün.

Son olarak, bir ilgi alanı seçin ve 800 nanometre iki foton uyarımı kullanarak DPA floresansını aktive edin. Floresan protein damlacık örnekleri, konfokal mikroskop fotokonversiyon uygulamaları kurmak için idealdir. Damlacık örneği doğru hazırlandığında, damlacıklar oldukça homojen görünür.

Buna karşın, örnek lamel cam kullanılmadan ve mikroskop lamı kaplanmadan hazırlandığında, hazırlanan örneklerde damlacıklar cam yüzeylerden birine doğru ezilme eğilimi gösterir. %0,1 BSA yokluğunda, floresan protein tek bir su arayüzünde birikme eğilimi gösterir. Floresans fotokonversiyon halesi oluşturmak, lazer gücüne ve maruz kalma süresine kritik derecede bağımlıdır.

Aşırı lazer gücü veya çok uzun maruziyet, fotobleaching'e neden olur ve fotokonvert edilen kırmızı floresansın azalmasıyla sonuçlanır. M orange two ve PHO'nun belirgin spektral özellikleri, fotokonversiyon öncesinde çift prob ile optik vurgulama yapılmasına olanak tanır; M orange two, histon H two B ve DPA mito eksprese eden hücreler çekirdekte turuncu floresans ve mitokondrilerde yeşil floresans gösterir. Düşük güçlü 488 nanometre eksitasyon ile tüm floresans kapatıldığında, M orange'ın fotokonversiyonu minimum düzeydedir.

İki M orange two, yüksek güçlü 488 nanometre eksitasyon ile kırmızıya fotokonverte edilebilir. M orange two fotokonverte edildikten sonra, drawn puff floresansı 800 nanometre iki foton eksitasyonu kullanılarak tekrar açılabilir. Çift prob optik vurgulama ile hücreler dört farklı şekilde etiketlenebilir.

Bu teknik kullanılarak, dört farklı hücre popülasyonu spesifik olarak işaretlenebilir. Gördüğünüz üzere, bu prosedürün en zor yönlerinden biri, m orange'ı fotokonverte etmeden MPA'yı inaktive etmektir. Bu yöntem uzmanlık düzeyinde öğrenildikten sonra, örneğin pankreatik beta hücrelerindeki birden fazla popülasyonun takibi gibi daha ileri deneyler gerçekleştirilebilir.

İşte bu kadar. Umarım bu sunumu faydalı bulmuşsunuzdur, deneylerinizde başarılar dilerim.