Optik Tuzak kullanarak Bakteriyel Hücre Bükme Rijitlik Ölçüm

Tekil E. coli hücrelerinin bükülme rijitliğini belirlemek için, önce bakterileri eksponansiyel fazda büyütün ve ardından onları kimyasal olarak işlem görmüş bir lamel yüzeyine tutturun. Yüzeye tutunmuş olan hücrelerin, esnek uçlar geliştirecek şekilde daha fazla büyümesine izin verin. Ardından, dielektrik boncuklar akıtın, bir boncuğu yakalayın ve onu bir hücrenin esnek ucuna doğru bükün.

Prosedürün son adımı, hücreyi optik tuzakla bükmek ve ortaya çıkan zorlanmış yer değiştirme verilerini ölçmektir. Hücrenin bükülme sertliği, zorlanmış yer değiştirme verilerine uygulanan doğrusal bir uyumla hesaplanabilir. Merhaba, ben Princeton Üniversitesi'ndeki Louis Sickler İntegratif Genomik Enstitüsü ve Fizik Bölümü'nde yer alan Profesör Joshua Shere'in laboratuvarından Steven Wong.

Bugün size, bireysel eko hücrelerin bükülmesi ve hücre sertliğinin ölçülmesi prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, farklı hücre içi yapıların bakteri hücrelerinin mekanik bütünlüğüne olan katkılarını incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Bu prosedüre başlamak için, herhangi bir e coli hücresinin üç mililitresini LB besiyerinde eksponansiyel faza kadar büyütün. Hücreler 600 nanometrede 0,2 ile 0,4 arasında bir optik yoğunluğa ulaştığında, filamentöz büyümeyi indüklemek için kültürü 15 dakika boyunca mililitre başına 50 mikrogram sefaleksin ile destekleyin. Bu 15 dakikalık süre boyunca bir akış odası hazırlayın.

İki parça çift taraflı bandı, aralarında üç milimetrelik bir boşluk kalacak şekilde bir lam üzerine yapıştırın ve üzerine bir lamel sabitleyin. Bant parçaları arasındaki boşluk, sıvı akışı için bir kanal oluşturur. Bir mikro pipet yardımıyla akış odasına 10 µL suda seyreltilmiş %1 polyethaline akıtarak lamelin PEI ile kaplanmasını sağlayın ve beş dakika inkübe edin.

Ardından, odacığın bir ucundan 200 µL su akıtarak yıkayın ve diğer uçtan vakumla toplayın. Bakterileri sefaleksin varlığında 15 dakika büyüttükten sonra, bir mililitre hücreyi mikro santrifüjde çöktürün ve sefaleksin içeren 200 µL LV içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra, yine bir uçta mikro pipet ve diğer uçta vakum kullanarak, konsantre hücre kültüründen 50 µL'yi kaplamalı lamelle tutulan odacığa akıtın ve üç dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, sefaleksin takviyeli 50 µL Vel B ile yıkayın. Yapışmamış hücreleri uzaklaştırmak için, hücreler inkübe edilirken optik tuzaklama cihazına yerleştirmeden önce, yapışmış hücrelerin büyümesine izin vermek amacıyla hazneyi 37 °C'de 30 dakika ile bir saat arasında inkübe edin. 0,5 µm çapındaki polistiren boncukların 3 µL'sini, suda seyreltilmiş %0,1 Polylysine içinde 30 dakika inkübe ederek poli-lizin kaplı boncuklar hazırlayın.

Boncukların inkübasyonu tamamlandığında, mikro santrifüjde çöktürerek ve bir mililitre su içinde yeniden süspanse ederek üç kez yıkayın, ardından boncukları bakterilere bağlayın ve hücrelerin bağlanma sertliğini ölçün. Bu protokolün en zor yönü, bükülme sertliği ölçümleri için uygun bir hücreyi tespit edebilmek, konumlandırmak ve tanımaktır. Uygun bir hücre, belirgin bir sabit uca ve serbest uca sahip olan hücredir.

Mikroskop üzerindeki akış odasında, belirgin bir şekilde sabitlenmiş ucuna sahip bir hücre arayın. Bazı hücreler sadece tek bir uçtan yapışmıştır ve diğer uçtaki bükülme kuvveti, hücrenin bükülmek yerine bir bütün olarak ekseni etrafında dönmesine neden olur. Uygun bir hücre bulmak için, joystick kontrollü tabla hareketini kullanarak her hücreyi optik cımbızla hızlıca bükün.

Uygun bir hücre bulunduğunda, boncuk çözeltisini sefalezin içeren LB içerisinde iki kat seyreltin; boncuk çözeltisinin 30 µL'sini, bir uçtan pipetleyerek ve diğer uçtan bir Kim wipe mendil ile nazikçe akıtarak akış odasına ekleyin. Yüzen bir boncuğu optik tuzakla yakalayın ve onu hücrenin serbest ucuna dokundurun. Yapışmamış boncukları uzaklaştırmak için odayı mikropipet ve 50 µL sefalezin içeren LB ile bir Kim white mendil kullanarak tekrar yıkayın. Ardından, hücreye bükme kuvvetleri uygulamak ve zorlanmış yer değiştirme verilerini kaydetmek için özel olarak yazılmış bir LabVIEW programını çalıştırın.

İlk olarak, tespit lazer ışını içindeki ekli boncuğu RA taraması yaparak detektör yanıtını kalibre edin ve 3D PSD voltaj sinyallerini kaydedin. Ardından, bir mikroskop görüntüsünde hücrenin uzun eksenini belirleyin. Uzun hücre ekseni belirlendikten sonra, hücreyi uzun eksene dik bir yönde adımlarla hareket ettirin; hücreyi hareket ettirirken kat edilen mesafeyi ve boncuğun optik tuzak merkezinden olan yer değiştirmesini kaydedin.

Son olarak, daha önce ölçülen tuzak sertliğini kullanarak yer değiştirme değerlerini uygulanan kuvvete dönüştürün ve kaydedin. Buradaki dosyaya kaydedilen uç yer değiştirmesi ve kuvvet verileri, tek bir hücreye ait zorlanmış yer değiştirme verileridir. Bu doğrunun eğimi, hücrenin eğilme sertliğidir.

E. coli'nin eğilme sertliğini bir optik tuzakla nasıl birleştireceğinizi size göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, belirgin bir sabit ucu ve serbest ucu olan uygun bir hücre bulmayı hatırlamanız önemlidir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.