Görselleştirme ve Miktar hücre içi Etkileşimleri Neisseria meningitidis ve İnsan

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücre içine alınmış bakterilerin, RIA Meningitidis'in,le hücre iskeleti proteini Alpha Actinin ile kolokalizasyon düzeyini değerlendirmektir. Bu işlem, bakterilerin hedef hücrelere girmesine izin vermek için kültürlenmiş insan beyin mikrovasküler hücrelerinin, bakterilerin gece boyu süren kültürüyle üç ila sekiz saat boyunca enfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, hücre içi bakteriler içeren hücreler yıkanır, tespit edilir (fikse edilir) ve ardından permeabilize edilir; bu işlem, enfekte kültürün hücre içine alınmış bakterilerin ve hücre içi alpha actinin'in immün boyaması için hazırlanmasını sağlar.

Konfokal görüntüleme ve kolokalizasyon yazılımının uygulanmasının ardından, hücre içi kolokalizasyon görüntüleri gözlemlenebilir ve konfokal mikroskobik görselleştirme ile kantitatif kolokalizasyon analizi sayesinde, Meninga Croci eksprese eden OPC'nin ve ayrıca membran proteininin, hücre içi alfa aktinin ile spesifik olarak etkileşime girebildiğini gösteren kantitatif sonuçlar elde edilir. Merhaba, ben Bri Üniversitesi Hücresel Moleküler Tıp Bölümü'nden Profesör Mata TI Laboratuvarı'ndan Isel Maria. Bugün size, hücre içi bakterilerinlelele sitoskeletal proteinlerin kolokalizasyon oranının düzeyinin tahmini için bir prosedür göstereceğiz.

Laboratuvarımızda, oto membran proteini OPC eksprese eden mycelium meningitis ile sitoskeletal protein alfa aktin arasındaki etkileşimi incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu çalışma, uygun bir güvenlik laboratuvarında gerçekleştirilmelidir.

İmmün boyama prosedüründen iki gün önce, ilgili bakteri suşunu beyin kalp infüzyonuna ekleyin. %10 ısıtılmış at kanı ile desteklenmiş agar plaklarını, immün boyamadan önceki gün, %5 karbon dioksit atmosferinde 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Gece boyu büyütülen bakteri kültüründen bir süspansiyon hazırlamak için 10 µL'lik bir kültür özesi kullanın.

Büyük bakteri agregatlarının çökmesini sağlamak için, iki mililitre PBSB içindeki süspansiyonu beş dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. Ardından, pellete dokunmadan süspansiyonun üstteki bir mililitresini steril bir tüpe aktarın. 20 mikrolitre bakteri süspansiyonu içeren iki viyale bir mililitre %1 SDS 0,1 molar sodyum hidroksit ekleyerek bakterileri çözün ve karıştırmak için tüpü ters çevirin. Bakteri sayılarını tahmin etmek için.

Çözeltinin absorbansını belirleyerek nükleik asit içeriğini ölçün. 216 anters'te, bakteriyel süspansiyonu insan beyin mikrovasküler endotel hücrelerini enfekte etmek için enfeksiyon ortamındaki gerekli yoğunluğa ayarlayın. İmmün boyamadan iki gün önce ekilmiş insan beyin mikrovasküler endotel hücreleri veya H-B-M-E-C-A için 16 mm'lik cam lamelleri 12 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin ve HBME hücrelerini lameller üzerine %50 konfluensta ekleyin; ertesi güne kadar 37 °C'de, %5 karbondioksit atmosferinde gece boyunca inkübe edin.

Laboratuvarımızda taze hazırlanan bakteriyel süspansiyon ile hücreleri enfekte edin. Hedef hücre başına 200 ila 300 koloni oluşturan birimlik bir enfeksiyon oranı rutin olarak kullanılır. Enfeksiyon süresinin sonunda, 37 °C'de %5 karbon dioksit içeren ortamda üç ila sekiz saat boyunca inkübe edin.

Hücreleri üç kez PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 30 ila 45 dakika boyunca 500 microliters %2 paraformaldehit ile sabitleyin. Paraformaldehidi yıkadıktan sonra, paraformaldehit ile sabitlenmiş hücreleri PBS ile seyreltilmiş %0,1 Triton X 100 içerisinde 10 dakika inkübe ederek permeabilize edin. Son olarak örnekleri üç kez PBS ile yıkayın ve gösterildiği gibi immün boyamaya geçin. Ardından, hücre içi bakterilerin ve dfor aktininin boyaması eş zamanlı olarak gerçekleştirilebilir.

12 kuyucuklu plaklarda, geçirgen hücreleri içeren lamelleri 30 ila 60 dakika boyunca 500 µl %3 B-S-A-P-B-S-T ile bloke edin. Oda sıcaklığında, PBS ile yıkadıktan sonra her bir lameli 12 kuyucuklu plaka içindeki yeni ve kuru bir kuyucuğa aktarın; bakterilere karşı primer antikorları ve alfa aktininle aynı anda uygulayın. Dikkatlice eklendiğinde, lamelin yüzeyini kaplamak için lamel başına 80 ila 100 µl antikor yeterlidir; oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonunda kuyucuğa 200 µl PBS ekleyin, lameli kaldırın ve 500 µl PBS içeren yeni bir kuyucuğa yerleştirin. Beş dakika sonra PBS'yi pipetleme yoluyla uzaklaştırın ve ardından taze PBS ekleyin. Bu işlemi iki kez tekrarlayın ve lamelleri yeni, kuru bir kuyucuğa aktarın.

Ardından, %1 B-S-A-P-B-S-T içinde seyreltilmiş, farklı florokromlarla konjuge edilmiş uygun sekonder antikorları ekleyin. Oda sıcaklığında, karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin; inkübasyon sonunda yıkama işlemi daha önce gösterildiği gibi uygulanır; ardından DNA'yı, oda sıcaklığında ve karanlıkta beş dakika boyunca DPI ile karşı boyayın. Bu inkübasyonun sonunda lamel camları bir kez PBS ile yıkayın ve ardından bir damla mount etme medyumu ile monte edin. Monte edilen lamel camlar, mikroskop altında gözlem aşamasına gelene kadar karanlıkta saklanmalıdır. Bir evirtilmiş epi-floresan mikroskoba bağlı konfokal lazer taramalı mikroskop kullanarak, immün olarak işaretlenmiş örneklerimizi gözlemleyip görüntülerini alırız.

CLSM prosedürüne başlamak için objektife bir damla immersiyon sıvısı damlatın ve numune lamının üzerindeki kapatma camını mikroskop tablasına yerleştirin; mikroskobu görsel moda getirip mikroskobun okülerlerini kullanarak ilgilenilen bölgeyi bulun, artık Leica yazılımını kullanmaya hazırız. XY z ekseni görüntüleme modunu seçin. Kolokalizasyon çalışmaları için 512 x 512 formatını seçin.

Çözünürlük ne kadar yüksek olursa, görüntü o kadar doğru olur. Ardından, tarama hızını artıran ve fotobleşin azaltılmasına yardımcı olan çift yönlü X modunu seçin. Ardışık tarama ayarlarını yapılandırın.

SEC fonksiyonuna tıklayın ve ardından hatlar arasından seçim yapın. Sekonder antikorlara konjuge olan florokromlara göre lazer ışınlarını seçin. DPI için 405 nanometre, Alexa Fluor 488 için 488 nanometre ve 561 nanometre.

Trixy için sırasıyla bir, iki ve üç numaralı fotomultipliyer tüpleri aktifleştirin. Z yığınının veya serisinin üst ve alt sınırlarını belirleyin. Ardından, Z adım boyutunu 0.2 micrometers olarak ayarlayın.

RIA Mencius diplo oküslüdür ve her bir oküsün yaklaşık çapı 0,5 µm olduğundan, 0,2 µm'lik bir Z adım boyutu, her bir oküsün en az iki kez taranma olasılığını artırır. Sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için üçlü hat ortalamasını seçerek nihai tarama parametrelerini ayarlayın ve başlat'a tıklayın. Farklı kromoforlar arasındaki çapraz etkileşimi ortadan kaldırmak için, farklı dalga boylarında ardışık tarama yaparak ve her kanal için hatlar arası modu kullanarak çift veya üçlü boyanmış görüntüler elde edilir.

İki florokromun kolokalizasyonunu belirlemek için, seçilen kanalları tek bir görüntüde birleştirmek üzere üst üste bindirme (overlay) işlevini seçin. Örneğin, hem Alexa 488 hem de trissy florokromlar kolokalize olduğunda, üst üste bindirilmiş görüntüde sarı renk görünecektir. Olası kolokalizasyonu görselleştirmek için gerekli olan 2D rekonstrüksiyon işlemi, maksimum projeksiyon işlevi kullanılarak Z-stack veya serilerle gerçekleştirilir. Z-stack veya seriler elde edildikten sonra, çeşitli elementlerin hücre içi lokalizasyonunu görselleştirmek amacıyla ortogonal bir görüntü elde etmek için verilerinizi işleyin.

Kolokalizasyon nicemlemesi, IMP tarafından sağlanan Vol City yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. Başlamak için CLSM görüntüleriyle bir kütüphane oluşturun ve üst çubuktaki görüntüden genişletilmiş odak (extended focus) seçeneğini belirleyin. Bu araç, analiz edilecek olan 2D görüntüde Z-yığınlarını (Z-stacks) birleştirecektir.

Şimdi COLOCALIZATION aracını seçin. Analiz edilecek iki kanalın renk derinlikleri aynı olmalıdır. Kantifikasyon yapılacak alanı seçin.

Herhangi bir arka planı temizlemek için eşik değerini ayarlayın. "Generate colocalization" seçeneğini belirleyerek kolokalizasyon çıktısını oluşturun. Daha önce seçilen ilgi alanları için kolokalizasyon istatistikleri oluşturulacaktır.

Ardından, Mander katsayıları R ve ny'yi seçin. Son olarak, veri sunumu için istatistik değerlerini bir Excel belgesine aktarın; burada sekiz saat boyunca meningokokla enfekte edilmiş insan beyin endotelyal hücrelerinin temsili konfokal görüntüleme sonuçları gösterilmektedir. Bakterilerin konumu kırmızı renkle gösterilmiştir.

Alfa aktininin konumu gösterilirken, yeşil oklar bakterilerin çevresinde yüksek derecede alfa aktinin birikiminin meydana geldiği bölgeleri belirtmektedir. Bu üst üste bindirme görüntüsünde, meninga occi ile alfa aktinin arasında kolokalizasyon olduğunu düşündüren sarı turuncu rengin görüldüğü birkaç bölge bulunmaktadır. Bir sonraki görüntüde, enfekte bir H-B-M-E-C monotabakasının optik diseksiyonu, bir hücrenin tabanında yer alan hücre içi bakterilerin çevresinde kolokalizasyon olduğunu göstermektedir.

Enfekte H-B-M-E-C monokatmanlarının üç boyutlu görüntüleri işlendiğinde, apikal yüzeyin eğik görünümü, kırmızı okla belirtilen kırmızıya boyanmış bir Durant bakterisini gösterirken, sarı okla belirtilen bölgelerde birçok bakteri endotel hücrelerinin bazal yüzeylerine doğru konumlanmıştır. Belirgin şekilde turuncu ve sarı renkli bir bazal konum, bu endon XZ kesitinde daha net bir şekilde görülebilir. İçselleştirilmiş bakteriler ile ya menton ya da aktinin etiketlendiği actinin deneylerinin aksine, H-B-M-E-C hücrelerinde aktin ile ara sıra kolokalizasyon görülse de fermente olanlarla kolokalizasyon nadirdir.

Önceki deneylerde gözlemlendiği gibi, Retin beyaz oklarla belirtilen birkaç internalize bakteri etrafında yoğunlaşmıştır. Göreceli örtüşmeyi elde etmek için veriler ayrıca analiz edilmiştir. Manda'ya göre, kolokalizasyonun gerçek derecesini temsil eden Katsayı R (toplam piksel sayısına kıyasla kolokalize olan piksel sayısı) ve OPC eksprese eden meningokoklar ile enfekte edilmiş H-B-M-E-C'lerdeki alfa aktinin, mentin ve aktin genelindeki NY değerleri için, meningokoklarda Retin'in %25'ten fazla örtüşme gösterdiği elde edilmiştir.

Katsayı Y, daha az bol olan meninga cocoa sinyali her oluştuğunda, daha bol olan rein sinyalinin frekansının bir ölçüsüdür. Bu ölçüm, internalize edilmiş meninga cockeye yakınında alfa aktininin çarpıcı bir düzeyde bulunduğunu göstermektedir. Bu deneyde, internalize edilmiş bakterilerinle hücre iskeleti elementlerinin nasıl görselleştirileceğini ve nicelendirileceğini size göstermekteyiz.

Yapıların bütünlüğünü korumak ve yüksek arka plan gürültüsünü önlemek için tespit ve immün boyama protokollerine kesinlikle uyulması gerektiğini unutmamak önemlidir. İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.