Fare Visual Cortex İnceltilen kafatası Hazırlık Kronik Görüntüleme

Dendritik dikenler, bir nöronun dendritinden çıkan ve sinaptik girdileri alan membran çıkıntılarıdır. Dikenlerin uzaması, kısalması, ortaya çıkması veya kaybolması, spesifik nöral aktivite paternlerinden kaynaklanan nöral ağ fonksiyonundaki değişikliklere yanıt olarak gerçekleşir. Dendritik dikenlerdeki morfolojik değişiklikleri gözlemlemek için kullanılan bu fenomen, kortikal plastisite olarak bilinir.

Canlı hayvanlarda, bir görüntüleme plakası farenin kafatasına sabitlenir. Kafatasının bir bölgesi cerrahi olarak inceltilir ve düşük ve yüksek büyütmede görüntüler alınır. Ardından, bu bölgeler daha sonraki zaman noktalarında yeniden görüntülenir.

Elde edilen sonuçlar, dendritik diken morfolojisinin ince kafatası preparasyonu kullanılarak birden fazla zaman noktasında net bir şekilde görselleştirilebildiğini göstermektedir. Ayrıca diken morfolojisinin oldukça plastik olduğu, yapıda değişiklikler ile dendritik dikenlerin ortaya çıkışı ve kayboluşu şeklinde kendini gösterdiği görülmüştür. Merhaba, ben Emily Kelly; Rochester Üniversitesi Nörobiyoloji ve Anatomi Bölümü'nde Anaya Maka'nın laboratuvarındayım.

Bugün sizlere, "fins called" preparasyonunun ardından fare görsel korteksinin kronik görüntülemesine yönelik prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü dendritik diken döngüsünü incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Prosedüre, aseptik cerrahi için aletleri sterilize ederek başlayın. Ardından çalışma alanını %70 etanol kullanarak sterilize edin ve operasyon yüzeyini temiz örtüyle kaplayın. Fentanyl kokteyli ile anestezi uygulanmış bir farenin anestezi derinliğini, ayak parmağı sıkıştırma yöntemine verdiği yanıtı test ederek izleyin; burada gösterilen fare, GFP eksprese eden A-G-F-P-M transgenik faredir.

Beşinci tabakada, dendritik uzantıları yüzeysel tabakalara gönderen parametal hücreler bulunur. 37,5 °C vücut sıcaklığını korumak için hayvanı bir ısıtma battaniyesine yerleştirin ve iliştirilmiş bir rektal termometre ile izleyin. Ardından, gözlerin kurumasını önlemek için gözlere oftalmik pomad uygulayın ve makas kullanın.

Fareyle kafasının arkasındaki tüyleri kulak arkasından gözlere kadar temizleyin. Ardından, hayvanın kafasının üst kısmını %70 etanol uygulayıp, ardından Betadine scrub ve Betadine solüsyonu ile temizleyin. Kulakların arkasından, hangi hemisfer görüntülenecekse orta hattın sağ veya sol tarafı boyunca gözlere doğru L şeklinde bir insizyon yapın, deriyi katlayarak cerrahi bölgeden uzaklaştırın.

Deri, daha sonra ince pensetler kullanılarak sütüre edileceği için çıkarmayın. Deriyi nazikçe yukarı ve ilgili bölgeden uzağa doğru çekin. Temiz bir penset kullanarak, kafatasının açığa çıkan bölgesindeki periostumu nazikçe kazıyarak temizleyin.

%10 fair klorürden küçük bir miktar uygulayarak periosteum membranını tamamen kurutun ve membranın tamamen uzaklaştırıldığından emin olun. Kafatasının tamamen kuru olması önemlidir. Yapıştırıcının düzgünce yapışmasını sağlamak için, kurumuş periosteum membranını mikrocerrahi bıçağı ile nazikçe kazıyın.

Ardından, paslanmaz çelik baş plağının görüntüleme penceresinin etrafına ince bir tabaka Sano akrilik yapıştırıcı uygulayın ve plağı kafatasına sabitleyin. Bir pamuklu çubuk çubuğunun ahşap ucuyla, görüntüleme penceresinin iç dikişlerine yapıştırıcı sürerek görüntüleme plağı ile kafatasının kavisli yapısı arasındaki tüm boşlukların dolduğundan emin olun. Pencerenin içine bir damla yapıştırıcı hızlandırıcı damlatın.

Ardından fazlalığı hızlıca silin. Yapıştırıcının tamamen kurumasını bekleyin. 0,7 milimetrelik paslanmaz çelik frez takılmış bir dişçi matkabı kullanarak, görüntüleme penceresindeki kafatasını inceltmeye başlayın.

Kafatası üzerinde aşırı ısı oluşumunu önlemek için, ara ara %0,9 steril salin uygulayarak alternatif delme işlemi gerçekleştirin. Kafatası yüzeyinde küçük darbeler kullanarak dört çarpı dört milimetrelik bir pencereyi inceltin.

Dental frezle işlem yapınız. Kafatasının inceliğini küt uçlu pensle test ediniz. Hafif baskı uygulandığında kafatası yüzeyinde hafif bir çökme oluşacaktır.

Görüntüleme için optimal kafatası kalınlığı 10 ile 30 mikron arasındadır. Kafatası inceltildikten sonra, pencereyi tüm kalıntılardan temizleyin ve kafatasının üzerine salin yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskobuna monte edilmiş dijital kamera ile görüntüleme penceresinin fotoğrafını çekin.

Bu fotoğraftaki beyin damarları, sonraki görüntüleme oturumları için görüntüleme plakasının yerleştirileceği konumun belirlenmesine yardımcı olacaktır. Hayvanı iki foton düzeneğine taşıyın. Hayvan ısıtma battaniyesi üzerinde kalmalı ve vücut sıcaklığı görüntüleme oturumu boyunca sürekli olarak izlenmelidir.

Mi Tai lazerli bir iki foton mikroskobu. Maksimum güç için 10 watt'lık bir katı hal pompa lazeri ve modifiye edilmiş bir Olympus flow view konfokal ünitesi kullanılmıştır. Sistem, derin doku görüntüleme için optimize edilmiştir ve beyinden gelen floresansın maksimum düzeyde saptanmasını sağlamak amacıyla harici dedektörler objektife mümkün olduğunca yakın kurulmuştur; düşük dijital yakınlaştırma kullanarak görüntüleme penceresine bir damla salin ekleyin.

Mikroskoba sabitlenmiş bir dijital kamera kullanarak parlak şekilde işaretlenmiş nöronlar içeren bir alan belirleyin. Ardından, görüntüleme alanının bir fotoğrafını çekin. Bu işlem, sonraki bir zaman noktasında aynı görüntüleme konumuna geri dönmek için gereklidir.

Dendritik dallanmanın kapsamını gösteren, beynin tüm görünür alanı boyunca düşük büyütmeli bir yığın elde edin. Kan damarları ve dendritler genç ve yetişkin hayvanlarda yapılarını koruduğu için, bu yığın sonraki zaman noktalarında görüntüleme alanını belirlemek için kullanılacaktır.

Dijital büyütmeyi sekiz kat artırın, gerekirse XY koordinatlarını ayarlayın ve dendritik dikenlerin konumları ile yapıları dahil olmak üzere ayrıntılı dendritik morfolojiyi gösterecek yüksek büyütmeli bir istif (stack) toplayın. Pan koordinatları, toplama aralığı, Z adım boyutu ve istifteki adım sayısı dahil olmak üzere her bir istif toplama işlemiyle ilgili ayrıntılı notlar alın. Bu notlar, daha sonraki bir zaman noktasında bu dendrit veya aksona geri dönerken kullanılacaktır.

Görüntülemenin ardından, baş plağını kafatası yüzeyinden nazikçe ayırarak çıkarın. Pens kullanarak kalan yapıştırıcı kalıntılarını temizleyin ve kafatasını %0,9 steril salin ile silin.

Kafatası üzerindeki deriyi 6 numara sütur ipi kullanarak dikin. Görüntüleme prosedürünün ardından bölgeyi %70 etanol ile silin. Hayvanı, uyanana ve hareketlenene kadar ısıtıcı bir lambanın altında temiz bir kafese yerleştirin.

Ardından, hayvanı iki gün ile birkaç ay arasındaki herhangi bir süre sonra tekrar görüntülemek üzere orijinal kafesine geri yerleştirin, dikişleri alın ve kafadaki deri kesisini tekrar açın. Aseptik yöntemler kullanarak, ilk ameliyat sırasında alınan beyin damarlanmasının dijital görüntüsünü, orijinal görüntüleme konumunu belirlemek için kullanın. Ardından, kafa plağını daha önce olduğu gibi yeniden sabitleyin.

Gerekirse, görüntüleme zaman noktaları arasında yeniden büyümüş olabilecek kemik dokusunu nazikçe inceltmek için mikrocerrahi bıçağı kullanın. Dişle matkabı ile inceltme işlemini yapın, görüntüleme penceresini kalıntılardan temizleyin ve bir damla %0,9 steril salin uygulayın. Hayvanı iki fotonlu mikroskoba taşıyın ve önceki oturum sırasında alınan dijital floresan görüntüyü kullanarak orijinal görüntüleme alanını bulun.

Akış görüntüleme programını başlatın. Orijinal düşük büyütmeli görüntüyü açın, bilgisayar ekranına şeffaf bir asetat kağıdı yerleştirin ve asetat kalemi kullanarak ana kan damarı paternini çizin. Ardından, canlı görüntüyü açın ve kan damar yapısını asetat filmi üzerine çizilen paternle yeniden hizalayın.

Sekiz kat yakınlaştırılmış yapıları yeniden görüntülemek için şeffaf filmi kaldırın. Önceki görüntüleme oturumundan toplanan istenen yığını açın. Yapıyı, bilgisayar ekranına sabitlenmiş bir şeffaf filme çizin.

Canlı görüntüden sekiz kat yakınlaştırın ve görüntüyü şeffaf tabaka ile hizalayın. Düşük büyütmeli konumun hizalama hassasiyetine bağlı olarak, görüntü açısını da hafifçe ayarlamak gerekebilir; pan koordinatlarını, adım boyutu ve görüntü sayısı dahil olmak üzere ilk günün görüntüleme parametrelerine göre ayarlayın ve z-stack görüntüleme işlemini gerçekleştirin; yeniden görüntüleme iki kez yapılabilir. Kafatası bütünlüğünün bozulmasını önlemek için skalpın açılma sayısı sınırlandırılmalıdır, aksi takdirde GFPM eksprese eden farelerde görüntüleme çözünürlüğü düşük olacaktır.

Beşinci katman parametal hücrelerinin bir alt kümesi ve bunlara karşılık gelen dendritik süreçler, in vivo iki foton lazer tarama mikroskobisi kullanılarak görselleştirilmiştir; burada GFP ile işaretlenmiş görsel korteks dendritleri gösterilmektedir. Bu görüntü, PIA'dan 175 mikronluk nihai bir derinliğe kadar her beş mikronda bir elde edilen tek bir görüntünün projeksiyonudur. Kutucuk içindeki bölge burada sıfırıncı günde ve ardından dördüncü günde daha yüksek büyütmeyle gösterilmiştir; sıfırıncı ve dördüncü güne ait dendritik dal görüntülerinin yüksek büyütmeli karşılaştırması sunulmuştur.

Bu görüntüler, beyaz ok uçlarıyla gösterilen stabil dikenciği, kırmızı ok ucuyla işaretlenen geri çekilen ve kaybolan dikenciği ve yeşil ok ucuyla gösterilen yeni dikenciği göstermektedir. Size, ince kafatası preparasyonu kullanarak fare görsel korteksinde kronik iki foton görüntülemenin nasıl yapılacağını göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, kafatasına ve altındaki duraya zarar vermemek için inceltme işlemi sırasında özel bir dikkat göstermek gerektiğini unutmamak önemlidir; çünkü bu durum görüntüleme çözünürlüğünün düşük olmasına neden olacaktır. Ayrıca ayrıntılı notlar alınız.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.