Kronik Beyin Görüntüleme Kraniyotomi Cerrahi Prosedür

Görüntüleme teknikleri, beyin fonksiyonlarının incelenmesinde giderek daha önemli hale gelmektedir. Bunlar arasında iki foton lazer mikroskopisi, uygun preparasyonlarla canlı beyin dokusunun incelenmesine olanak tanıdığı için son derece yararlı bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu teknik, aynı kortikal alanın dakikalardan aylara kadar kronik olarak gözlemlenmesine imkan tanır.

Bu videoda, iki foton mikroskobisi kullanarak beynin kronik in vivo görüntülemesi için bir hazırlık yöntemini gösteriyoruz. Bugün uygulamalı olarak sunacağımız kraniyal pencere hazırlığı, başlangıçta Janelia Farm'daki Howard Hughes Medical Institute araştırmacısı Dr. Carl Voda tarafından öncülük edilmiştir. Merhaba, ben California Üniversitesi Los Angeles Nöroloji Bölümü'ndeki Carlos Porter Cayo laboratuvarından Ricardo Must.

Bugün size kronik in vivo görüntüleme için kraniyal pencere oluşturma prosedürünü göstereceğiz. Bu hazırlık, iki foton lazer mikroskobu kullanarak beynin derinliklerini görüntülemeye olanak tanıdığı için oldukça faydalıdır. Hadi başlayalım.

Cerrahi işleme başlamadan önce fareler izofluran ile anestezi altına alınır. İndüksiyon için %4, cerrahi işlem sırasında ise %1,5 ila %2 oranında, I-A-C-U-C onaylı prosedürler kullanılarak anestezi uygulanır; hayvanın tamamen sedatize olduğunu doğrulamak için kuyruk ve/veya ayak parmağı sıkıştırma yöntemlerinin kullanılması önemlidir. Bir kemirgen tüy kırpma makinesi kullanılarak, ense bölgesinden gözlere kadar olan tüyler tıraş edilir.

Tıraş işleminin ardından fare, 37 °C'ye ayarlanmış su sirkülasyonlu bir battaniye üzerine yerleştirilerek stereotaksik çerçeveye sabitlenir ve kulak barları kullanılarak başı sıkıca sabitlenir. Ardından, hayvanın gözlerinin kurumasını önlemek için göz merhemi uygulanır. Sonrasında, kilogram başına 0,2 mg dekzametazon ve kilogram başına 5 mg karprofen deri altına uygulanır.

Sırasıyla beynin şişmesini ve/veya inflamatuar bir yanıtı önlemek için. Cerrahi işleme başlamadan önce, cildi sırasıyla %70 alcohol ve Betadine ile üç kez silerek operasyon bölgesini sterilize ettiğinizden emin olun. Tüm cerrahi aletler, etanol püskürtülmüş makaslar kullanılarak bir cam boncuk sterilizatörü ile önceden sterilize edilmiştir.

Kafanın tabanı boyunca yapılan yatay bir kesi ile başlanarak kafatasının üzerindeki deri kaldırılır, ardından göz kapaklarına neredeyse ulaşan rostral yönde iki kesi yapılır. Sonrasında, orta hatta birleşen iki oblik kesi uygulanır. Bu noktada, aşırı kanamayı veya ağrıyı önlemek için periosteuma bir damla lidokain ve epinefrin solüsyonu uygulanır ve bir skalpel yardımıyla periosteum kafatasının kenarlarına doğru geri çekilir.

Boynun arkasındaki kaslar da hafifçe geri çekilir. Ardından, kuru bir yüzey oluşturmak için kafatasının açığa çıkan tüm alanı bir skalpel ile nazikçe kazınır. Bu işlem, daha sonra uygulanacak olan yapıştırıcının daha iyi yapışmasını sağlayacağı için oldukça önemlidir.

Görüntüleme alanı seçildikten sonra, öncelikle kranial pencerenin oluşturulmasına geçilir. Pnömatik bir dişle matkabı ile yaklaşık dört milimetre çapında bir daire nazikçe çizilir. Hafif bir delme işleminden sonra, kafatası yüzeyine tekrar lidokain epinefrin solüsyonu uygulanır.

Genellikle tek bir saç teli kalınlığında çok ince bir kemik tabakası kaldığında delme işlemi durdurulur. Bu aşamaya, bir damla salin altında nasıl esnediğini hissetmek için kraniyotomilerinin merkezine hafifçe bastırarak ve kemiğin süngerimsi bir yapısı olan kemik trabekülalarından yararlanılarak ulaşılır.

Kraniyotomi parçası, çok ince uçlu pensler yardımıyla kafatasından kaldırılır. Salin kullanımı, kafatasının kaldırılmasına yardımcı olduğu ve duranın kanamasını önlediği için önemlidir. Ardından, kafatası kaldırılırken bazen meydana gelen küçük kanamaları durdurmak amacıyla, daha önceden salin içinde bekletilmiş jel sünger dura matere uygulanır.

Dura mater yüzeyi kurutulduktan ve kanama olmadığına emin olunduktan sonra, beş milimetrelik steril bir cam lamel dura materin üzerine nazikçe yerleştirilir. Kafatasındaki karşı hemisfer üzerine bir damla siyanoakrilat bazlı yapıştırıcı uygulanır. Bir iğne yardımıyla, yapıştırıcı, camın altına kaçırmamaya dikkat ederek pencerenin çevresine nazikçe yayılır.

Yapıştırıcı artık kafatasının tüm yüzeyine ince bir tabaka halinde uygulanabilir. Yapıştırıcı kuruduktan sonra, dental akrilik karıştırılır ve kapatma lamının küçük bir kenarını da örtecek şekilde kafatası yüzeyine uygulanarak sabitlenir. Kapatma lamı sabitlendikten sonra, dental akrilik ile pencerenin etrafına küçük bir kuyu oluşturulur.

Dental akriliğin içine bir titanyum çubuk da yerleştirilir. Bu çubuk, daha sonra fareyi mikroskop tablasına güvenli bir şekilde sabitlemek için kullanılacaktır. Görüntüleme için, çubuğun kraniyal pencereye paralel olması amacıyla düz olduğundan emin olmak önemlidir.

Çubuğun altına bir parça kâğıt yerleştirmek, akrilik sertleşene kadar çubuğun düz kalmasını sağlayabilir; dental akriliğin kürlenmesi veya sertleşmesi için 10 dakika beklenir ve bu sürenin sonunda titanyum çubuk yerine sabitlenmiş olur. Ardından hayvan, iyileşene kadar sıcak bir kafese yerleştirilir. Anestezi sonrası iyileşme tamamlandığında, hayvan aynı gün içerisinde görüntüleme işlemine tabi tutulabilir.

Bu video, üç aylık bir GFPM faresinin somatosensory korteksine yerleştirilen bir kranial pencere aracılığıyla, özel yapım iki foton mikroskobumuzla beş mikron aralıklarla çekilmiş 160 görüntülük bir yığını göstermektedir. Farelerin bu transgenik hattı, piramidal nöronların küçük bir alt kümesinde GFP eksprese eder. Tabaka beş ve tabaka iki üç'te görüntüler, 910 nanometre uyarma dalga boyu kullanılarak 0,8 sayısal açıklığa sahip 40 x su daldırma objektifi ile alınmıştır.

Daha yüzeysel görüntülerde, parametal hücrelerin apikal dendritlerinin dendritik ağaçlarını tanımak kolaydır. Her nöronun dendritlerinin apikal demeti, tek bir büyük apikal dendritte birleşir. Bu ana apikal dendritten ayrılan daha küçük oblik dendritler de görülebilir; ayrıca görüş alanını geçen aksonlar da belirgindir.

Bu, aynı 40 x objektif kullanılarak her bir buçuk mikronda bir çekilmiş 12 görüntüden oluşan bir yığındır; yüksek büyütmede, tekil dendritik dikenlerin ayırt edilebileceği kadar yüksek çözünürlükte yüzeysel bir dendrit gösterilmektedir. Size, iki foton mikroskobisi kullanarak beynin kronik görüntülemesi için nasıl kraniyal pencere hazırlığı yapılacağını göstermiş olduk. Bu, yaşayan beynin hem yapısını hem de işlevini sadece tek bir görüntülemede değil, aynı zamanda aylar süren dönemler boyunca çoklu görüntülemelerle kronik olarak incelemenize olanak tanıdığı için beyin çalışmaları adına son derece güçlü bir yöntemdir.

Kraniyal pencere hazırlığının bir diğer avantajı, geniş bir görüş alanının görüntülenebilmesidir; bu da tüm bir akson veya milimetrelik mesafelere yayılan dendritik ağaç gibi büyük yapıların görüntülenmesini mümkün kılar. Bu prosedürü uygularken, mümkün olan en temiz ve en steril koşullarda çalışmayı ve ellerin çok sabit olmasını hatırlamak önemlidir. Tamam, işte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.