Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Görsel deneyimimiz, retinal fotoreseptörlerimizdeki görsel pigmentin ışık enerjisi fotonlarını absorbe etmesiyle başlar ve bu durum nihayetinde hücre membranındaki siklik nükleotid kapılı kanalların kapanmasına yol açar. Bu durum, hem çomaklar hem de koniler tarafından nörotransmitter glutamat salınımını baskılar. Salınan glutamat, alt sinyalleri incelemek amacıyla alt retinal hücreler tarafından algılanır.

Ötanazi uygulanmış bir fareden gözler çıkarılır. S'ler izole edilir, bir agar bloğuna gömülür ve titreşimli bir mikrotom kullanılarak dilimlenir. Ardından, retinal dilimler bir mikroskobun altına yerleştirilir ve LED aydınlatma ile uyarılır.

Senerjik akımları veya potansiyelleri ölçmek için patch clamp kayıtları alınırken, bu yönteme yeni başlayan kişiler genellikle karanlıkta çalışmanın getirdiği ek zorluklar nedeniyle sorun yaşarlar. Bu nedenle, tüm sürecin görselleştirilebilmesi, aksi takdirde tarif edilmesi zor olan bir deneyim ve aşinalık sağlayacaktır.

Bu prosedüre, kullanılacak kayıt ve referans tel elektrotlarını bir gümüş klorür tabakasıyla kaplayarak başlayın. Elektrotları bir molar sodyum klorür içine daldırın. Ardından, bir hertz sinüs dalgası sürücüsüne sahip 15 voltluk bir güç kaynağı kullanarak, aralarında yaklaşık 20 saniye boyunca 15 volt uygulayın.

Bir mikro pipet çekici kullanarak, ateşle cilalanmış BO silika camdan patch pipetler hazırlayın ve yaklaşık 20 mikron çapındaki hücre gövdeleri için hedef hücrelerin boyutuna göre bir pipet uç direnci seçin. Hücre gövdeleri için beş ila 10 mega ohm uç direncine sahip bir pipet kullanın. Çapı yaklaşık beş mikron olanlar için 12 ila 15 mega ohm uç direnci kullanın.

Toprak referans elektrotlarını hazırlamak için, bir şırınga kullanarak polietilen tüpleri bir milimolar sodyum klorür içinde hazırlanmış %3,5'lik agar çözeltisi ile doldurun. Ardından, eşlik eden yazılı protokoldeki talimatlara göre şu çözeltileri hazırlayın: Harici banyo çözeltisi, dilimleme çözeltisi, potasyum aspartat pipet iç çözeltisi ve agar arka stopu.

Tüm solüsyonları ihtiyaç duyulana kadar dört santigrat derecede saklayın. Deney gününde, yaklaşık 1,5 mililitre potasyum aspartat iç solüsyonu ekleyin. Ardından seyreltilmiş Fluor ekleyin.

Sodyum bikarbonat içeren yaklaşık 50 mililitre aims ortamını ışık geçirmeyen saklama kabına dökün. Aims ortamını gazla dengelemek için plastik tüpü %5 karbon dioksit ve %95 oksijen içeren bir gaz tüpüne bağlayın ve ardından kabı 30 ila 32 °C sıcaklığındaki bir su banyosuna yerleştirin. Sonrasında, bir şişeyi HEPES içeren 110 mililitre aims ortamı ile doldurun ve buz üzerine yerleştirin.

Çözeltiyi %100 oksijen gazı ile kabarcıklandırarak ortamı dengeleyin. Sodyum bikarbonat içeren geri kalan aimes ortamını Faraday kafesinin üstündeki ısıtmalı rezervuara yerleştirin. Gazı çözeltinin üzerindeki boşlukta hapsetmek ve %5 karbon dioksit, %95 oksijen gazı ile dengelemek için tüplerin ve şişe kapağının etrafını parafilm ile sarın.

Cam bir hava dağıtım tüpü kullanarak, 0,75 gram düşük jelleşme sıcaklıklı agarı 25 mililitre aims medium'a ekleyip ısıtarak %3'lük düşük jelleşme sıcaklıklı agar hazırlayın. Karıştırırken çözeltinin sıcaklığı yaklaşık 115 °C olmalıdır. Çözelti kabarcıksız ve berrak hale geldiğinde, eritilmiş agar çözeltisini 42 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.

Kayıt odasını ters mikroskop üzerine kurun. Beş santimetrelik agar köprüsünü gümüş, gümüş klorür referans elektrodu üzerine kaydırın ve kayıt odasına yerleştirin. Pipet ucu direnci, bir pipet iç çözelti ile doldurularak, pipet tutucuya yerleştirilerek, pipet tutucu amplifikatör kafa katına takılarak ve pipet çözeltiye daldırılarak ölçülebilir; fizyolojik kayıtlar için görsel pigmenti korumak amacıyla tüm prosedürler kızılötesi gözlükler kullanılarak kızılötesi ışık altında gerçekleştirilmelidir, ancak tüm prosedürler burada oda ışığında gösterilecektir.

Fare ötanazi edildikten sonra, gözleri hızla çıkarmak için kavisli makas kullanın. Gözlerin yuvarlanmasını önlemek için onları bir parça filtre kağıdının üzerine yerleştirin. Ardından, bir gözü pensetle sabit tutun ve korneada bir kesik oluşturmak için ince çift taraflı bir bıçak kullanın.

Göz küresi delinir delinmez, gözü aims ortamı ile doldurulmuş 60 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. Korneadaki yarığı giriş noktası olarak kullanarak, korneanın geri kalan kısımlarını küçük makaslar yardımıyla kesin.

Ardından, retinanın göz çukuruna yapışık kaldığından emin olarak lensi ve vitreus humoru çıkarın. Bunu, 32 °C'de %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile dengelenmiş aims ortamı ile doldurulmuş ışık geçirmeyen bir kaba yerleştirin.

Sıradaki hemis kesiti. 10 numaralı bistüri ucu kullanarak göz kaplarından birini kesin. Retinayı retinal pigment epitelyumundan ayırın.

Dokunun düz bir şekilde yayılmasını sağlamak için retinanın kenarlarını kesin. Lateks ampullü küçük bir cam pasta pipeti kullanarak 35 milimetrelik bir Petri kabını eritilmiş düşük jelleşme sıcaklıklı agarla doldurun ve ağarın kıvamını test etmek için penseti ağarın içinde sürükleyin. Agar katılaşmaya başladığında, retinayı agarın üzerine aktarın.

Ardından retinaya dokunmadan, çevresindeki fazla solüsyonu emmek için bükülmüş bir Kim wipe parçası kullanın. Retinanın üzerine doğrudan iki ila üç damla daha agar yerleştirin ve retinayı silindirin merkezine yakın tutarak etrafında bir duvar oluşturmak için hızla plastik bir silindir yerleştirin; ardından ek eritilmiş agar damlatın ve soğuması için Petri kabını buzlu su banyosuna aktarın. 30 saniye sonra dokuyu çıkarın ve retinaya en uzak taraftan iterek agar bloğunu dışarı çıkarmak için bir piston kullanın.

Retinayı içeren küçük bir agar bloğunu kesmek için tek taraflı bir jilet kullanın ve bu bloğu numune diskindeki agar destekle karşı karşıya gelecek şekilde hızlı yapıştırıcı ile sabitleyin. Numune diskini titreşimli mikrotom ağacına aktarın ve retinayı içeren bloğun tamamen suya gömülmesini sağlayacak şekilde ağaca buz gibi soğuk AIMS çözeltisi dökün. Maksimum bıçak titreşim hızını ve retinayı tek seferde kesmenin dört ila beş saniye süreceği şekilde ayarlanan bir ileri bıçak hızını kullanarak yaklaşık 200 mikron kalınlığında retina dilimleri kesin.

Bloktan kullanılabilir her bir kesiti tek tek çıkarmak için 11 numara bistüri ucu kullanın. Retinayı içeren kesitleri kayıt odacıklarına yerleştirin ve onları aşağıda tutun. Kesit sabitleyicilerini kullanarak naylon iplikleri kesit sabitleyicinin üzerine geçirin.

Retinayı engellemeyecek şekilde, retinayı çevreleyen agar tabakasını sabit tutun. Kayıtlar için kayıt odasını dik mikroskobun tablasına aktarın.

Perdeyi kapatın ve kızılötesi hassasiyetli bir kamerada kesite bakmak için kızılötesi ışık kaynağını açın. Mikroskop altında, uygun kesim açısına sahip ve fotoreseptörleri sağlam olan bir retina kesitini belirleyin. Kesme işlemi nedeniyle bazı yüzey hasarları belirgin olabilir.

Kırık uçlu bir pipet kullanarak ölü hücre gövdelerini nazikçe emdirin. Bu ince hücre tabakasını uzaklaştırmak için, sağlıklı bir canlı hücre tabakası ortaya çıktığında, konumu ilgilenilen katmanlarda olan bir hücre gövdesini belirleyin. Pipet ucunu hücre membranında küçük bir çöküntü oluşturacak şekilde hareket ettirin ve yüksek dirençli bir sızdırmazlık sağlamak için nazik, negatif veya içe doğru basınç uygulayın. Hücre içine girmek için elektroda negatif basınç uygulanarak tüm hücre modu sağlanabilir.

Ardından, yanıtları uyandırmak için LED'ler kullanarak retinal dokuyu ışıkla stimüle edin. Kaydın sonunda, pipet iç solüsyonundan hücreye diyalize olan Flor için uygun eksitasyon ışığını kullanarak bir görüntü yakalayın. Burada, karanlığa adapte olmuş bir retinal nöronun, şiddeti artan ışık flaşlarına karşı verdiği ışıkla uyarılmış potansiyeller gösterilmektedir.

Bu şekil, hücrelerin Lucifer yellow floresan boyası ile doldurulduğu bir retinal kesitten alınmış floresan görüntüsüdür; uyarılan floresan, patch kayıtlarının yapıldığı hücrelerin morfolojisini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, karanlığa adapte edilmiş retinal kesitlerden patch clamp kayıtları yapmanın getirdiği bazı karmaşıklıkları daha iyi kavramış olmalısınız. Bu prosedürün amacı, kontrollü aydınlatma altında ışıkla uyarılmış yanıtları ölçmektir.

Bunu yapabilmek için öncelikle retinayı izole etmemiz, onu agar içine gömmemiz ve ardından tek hücre kayıtları yapabileceğimiz retinal dilimler hazırlamamız gerekir.