Patch-kelepçe Kapasitans Ölçümler ve Ca ^{2 +} Retina Dilimleri Tek Sinir Terminalleri Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, presinaptik bipolar hücre sinir terminallerinde yer alan mikro devrelerin incelenmesi için agar gömülü retinal dilimler hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle karanlığa adapte edilmiş bir japon balığı gözünden retina elde edilip bu retinadan küçük dikdörtgen bir parça kesilerek gerçekleştirilir. Retinal parça daha sonra şeffaf ve düşük erime noktalı bir agar çözeltisine daldırılır ve ardından soğuk bir dilimleme çözeltisi içerisinde katılaştırılır.

Bir sonraki adım, dikdörtgen retina parçasını içeren katı agar bloğunu bir vibratom kullanarak dilimlemektir. Son adım ise görüntüleme, tanımlama ve yamalamadır. Bir bipolar hücre sinir terminalini klemp ile sabitleyin.

Sonuçlar, atomize edilmiş ve sağlam bipolar hücre terminallerinden elde edilen membran kapasitans ölçümleri ile presinaptik kalsiyum akımını ve sinaptik fiziksel eksositozu göstermektedir. Merhaba, benim adım Han Kim. Burham Enstitüsü'ndeki PCO laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım.

Bugün, soğuk fasiyal retinadan AGA gömülü kesit hazırlamayı tanıtacak ve tek bir boru hattında patch clamp kapasitans ölçümünü göstereceğim. Bu prosedüre başlamak için, bir yaylı makas yardımıyla gözün ön kısmından eşit şekilde keserek bir japon balığının her gözünü ikiye ayırın. Ardından, göz kaplarını kalsiyum içermeyen soğutulmuş kesit solüsyonuna yerleştirin.

Gerekirse lensi cımbızla çıkarın. Ardından, retinayı göz çukurundan 45 derecelik açılı uçlu ince bir pensle soyarak retinaya yapışık olan pigment epitelyumunu uzaklaştırın. Bundan sonra, optik siniri ince bir pens veya yaylı makas kullanarak kesin.

Ardından, modifiye edilmiş bir pasta pipeti veya büyük uçlu bir transfer pipeti ile aspirasyon uygulayın. Retinayı çıkarmak için, retinaya yapışık kalan pigment epitelinin geri kalanını nazikçe temizleyin. Temizlenmiş ve sağlıklı retinanın yüzeyi pürüzsüz görünmelidir.

Ardından, izole edilen retinayı oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika boyunca yaklaşık %0,03'lük IDE ile muamele edin. Vitreus hümörünü uzaklaştırmak için işlemin düşük ışık altında gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın. Bir sonraki adımda, kavisli kenarları bir jilet yardımıyla temizleyerek, retinanın tam kalınlığını içeren yaklaşık ikiye iki milimetrelik dikdörtgen bir retina parçası kesin.

Ardından, retinal parçayı agar çözeltisiyle doldurulmuş küçük bir kaba aktarın ve retina sıvı agara yerleştirilirken çevresindeki çözelti miktarını minimize etmeye çalışın. Daha sonra, agarı katılaştırmak için retinanın bulunduğu agarı doğrudan buz soğukluğundaki dilimleme çözeltisine daldırın. Sonrasında, dikdörtgen retina parçasını içeren katı agar bloğunu bir santimetreye bir santimetreye bir santimetrelik bir küp şeklinde kesin.

Bloku, ön soğutma dilimleme odasındaki dilimleme plakasının yüzeyine yapıştırın. Ardından bloku, buz gibi soğuk dilimleme solüsyonu içerisinde 200 ila 250 mikron kalınlığında dilimlere ayırın. Bir vibratom kullanarak, yaklaşık beş ila altı saat boyunca canlı kalabilen toplam beş ila 10 dilim elde edilebilir.

Ardından, dilimlerden birini kayıt odasına aktarın. Dilimin üzerine, naylon ipliklerden oluşan bir ızgaraya sahip U şeklinde platin bir çerçeve yerleştirin. Dilimi, karbogen ile havalandırılmış kayıt solüsyonu ile dakikada bir ila iki mililitre hızında sürekli olarak perfüze edin.

Bu adımda, cam patch pipetiyle iç solüsyonu pipetin arkasından bir ila iki santimetre seviyesine kadar doldurmak için 0,2 mikron filtre uçlu bir şırınga kullanın. Ardından, ucundaki hava kabarcıklarını giderin. Pipeti tutucuya sabitleyin.

Pipete pozitif basınç uygulayın ve ucu kesit boyunca aşağıya doğru hareket ettirirken, bir mikro manipülatör kullanarak pipeti hedeflenen terminale doğru ilerletin. Kesitin uçla birlikte çekilmediğinden emin olmak için pipeti yanal bir süpürme yönünde hareket ettirin. Ardından, membran yüzeyini temizlemek için pipet ucunu terminalin etrafında gezdirin.

Bir girinti oluşturmak için pipet ucunu terminal kenarına doğru aşağıya doğru itin ve pozitif basıncı serbest bırakın. Eğer hemen bir giga ohm sızdırmazlığı oluşmazsa, pipete hafif bir negatif basınç uygulayın. Giga ohm sızdırmazlığı oluştuktan sonra, E PC nine patch clamp amplifikatörünü onsell kayıt moduna getirin ve tutma potansiyelini eksi 60 veya eksi 70 milivolt olarak değiştirin.

Hızlı kapasitans düzeltmesini uygulayın ve sızdırmazlığın 5 ile 10 giga ohm arasında stabilize olmasını bekleyin. Ardından, tüm hücre kayıt konfigürasyonunu oluşturmak için membranı keskin ve nazik bir vakumla yırtın.

Şırınga yerine ağızla vakumlama yöntemini de kullanabilirsiniz. Tüm hücre konfigürasyonu atomize edilmiş bir MB terminali üzerinde kurulduktan sonra, -70'ten 0 milivolta 200 milisaniyelik bir basamak depolarizasyonu uygulayın. Bu depolarizasyondan önce ve sonra, voltaj klempli modda iki kilohertz'lik bir sinüs dalgasının uygulandığını unutmayın. Membran kapasitansını ölçmek için yapılan bu depolarizasyon, sezyum bazlı bir iç çözelti kullanılarak, voltaj kapılı L tipi kalsiyum kanallarının açılmasıyla aktive olan içeri yönlü kalsiyum akımlarının doğrudan ölçülmesine olanak tanır.

Paralel olarak, membran yüzey alanını artıran sinaptik veziküllerin kalsiyuma bağımlı ekzositozunun neden olduğu kapasitans sıçraması izlenebilir. Eğer sağlam bir MB bipolar hücresinin sinaptik terminali pipetle yamalanırsa, MB bipolar hücrelerinin gap junction (boşluk bağlantısı) eşleşmesinden kaynaklanan büyük sızıntı akımları nedeniyle belirgin kalsiyum akımları gözlemlenemeyecektir. Gözlemlenen şey, büyük bir dışa doğru sızıntı benzeri akımdır.

Bununla birlikte, gösterilen depolarizasyon adımından önce ve sonra aktifleştirilen yüksek frekanslı sinüzoidal bir uyaran ile kapasitans sıçraması hâlâ izlenebilmektedir. Burada I-R-D-I-C örnekleri, M bipolar hücre terminallerinin görüntüleri yer almaktadır. Sağlam terminallerin A ve B'de gösterildiği gibi eliptik görünme olasılığı daha yüksekken, C yuvarlak ve dairesel görünen okside olmuş terminali göstermektedir.

Boya doldurma yöntemi aynı zamanda hücre terminallerini sınıflandırmak için de kullanılabilir. Burada, D'de sağlam aksona, e'de kısmen kesilmiş aksona ve F'de tamamen çıkarılmış aksona sahip MBI bipolar hücre terminallerinin floresan görüntü örnekleri yer almaktadır. Terminalleri mavi oklarla belirtilmiştir. Burada, kalsiyum görüntüleme sinyallerinin ekzositoz ve inhibitör geri bildirimin doğrudan ölçümleri gösterilmektedir.

Bir MB bipolar hücre terminalinde, MB terminalinin teleria bölgelerindeki geçici kalsiyum konsantrasyonu artışı, voltaj clamp basamak depolarizasyonu ile aktive edilmiştir; MB teleria bölgelerine ait ilgili floresan görüntü B'de görülebilir. Nörotransmitter salınımındaki kısa süreli sinaptik depresyon örnekleri C'de gösterilmiştir. Bu prosedür uygulanırken, retina kit agarına yerleştirilirken etrafındaki solüsyon miktarının minimize edilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu işlem, Latinized'in agar bloğuna tutunmasını iyileştirecektir.