3 Larvaların segmental sinirler Görselleştirme ^Rd Instar Drosophila Larvaların Hazırlıkları

Aksonal transport, larval segmental sinirlerin görselleştirilmesi yoluyla incelenebilir. Üçüncü instar bir drosophila. Larva önce diseke edilerek optik loblara, ventral gangliyona ve segmental sinirlere zarar vermeden Merkezi Sinir Sistemi (CNS) açığa çıkarılır.

Prosedürün ikinci adımı, lavayı birincil antikor ile gece boyunca ve ikincil antikor ile karanlıkta bir saat boyunca inkübe etmeden önce formaldehitte sabitlemektir. Daha sonra lava bir lam üzerine monte edilir ve aksonal taşıma kusurları, protein lokalizasyonu ve protein dağılımı immünofloresan mikroskopi aracılığıyla incelenebilir.

Bu yöntem aksonal transport hakkında bilgi sağlayabilse de, sinaps ve kas morfolojisi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, özellikle beyin segmental sinirlerini ve kaslarını sağlam tutarak bu izin verilen diseksiyonu gerçekleştirmenin başlangıçta zor olması nedeniyle güçlük çekeceklerdir. Bu prosedüre başlamak için, bir katı diseksiyon tamponu fiksatifi, bir katı PBT ve %5 BSA çözeltisi hazırlayın.

Diseksiyon öncesinde gösterilen tabloda detaylandırıldığı üzere, diseksiyona başlamak için temiz bir çift 5 numara pens, temiz bir çift düz uçlu makas ve raptiyeleri hazır bulundurun; gezinen üçüncü evre yıldız larvaları belirli bir genotipe göre seçip bir Petri kabına toplamak için mikro kaşık kullanın. Ardından, tüm besinlerden arındırmak için larvaları deiyonize suyla doldurulmuş bir Petri kabında durulayarak yıkayın.

Ardından, bir larvayı sırt kısmı yukarı gelecek şekilde S koruma kabına yerleştirin. Larvayı ön ve arka uçlarından iğneleyin. İğnelenmiş larvanın üzerine ince makas kullanarak bir damla tek seferlik diseksiyon tamponu damlatın.

Arka uca yakın dorsal orta hattaki lavayı sıkıştırın. Makas kullanarak, lava kütikülünü arka uçtan ön uca doğru kesin. Diseke edilen lavanın üzerine bir damla 1x diseksiyon tamponu damlatın.

Bir iğne kullanarak, larvaların ortasına yakın bir noktada kütikülün bir yan kenarını kaldırın ve kütikülü başka bir iğne ile sabitleyin. Kütikülün ikinci yan kenarı için de iğne kullanın; diyagramda gösterildiği gibi her yan tarafta ikişer iğne kullanılır. Şimdi, sadece iki optik lob ve ventral ganglionlarla birlikte beyni bırakacak şekilde bağırsakları, yağ cisimlerini ve trakeaları dikkatlice çıkarın.

Segmental sinirler bağlandıktan sonra, larvalar koruma kabına sabitlenmiş haldeyken fiksasyon ve antikor boyama işlemleri gerçekleştirilir. Diseke edilmiş larvaları 50 µL fiksatif içinde 30 dakika boyunca inkübe edin. Fiksasyon sonrası fiksatifi her 15 dakikada bir yenileyerek, larvaları bir kez PBT ile 30 dakika boyunca yıkayın.

Tampon çözelti her 10 dakikada bir yenilenirken, larvaların her zaman tampon içinde daldırılmış olması gerektiğini belirtmek önemlidir. Birincil antikor çözeltisini, %5BSA çözeltisi içinde uygun konsantrasyona seyrelterek hazırlayın. Optimal konsantrasyonlar farklı antikorlar için farklılık gösterir.

Plastik bir kabı suyla ıslatılmış Kim wipe ile kaplayarak nemli bir hazne oluşturun. PBT'yi son bir kez değiştirin.

Hazırlanan primer antikor çözeltisi ile durulayın ve nemli odada dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Diseke edilmiş larvaları, tampon çözeltiyi her 10 dakikada bir yenileyerek 1x PBT içerisinde 30 dakika boyunca durulayın. Sekonder antikoru, %5 BSA çözeltisi içinde uygun konsantrasyona seyrelterek hazırlayın.

Ve bazı ikincil antikorlar ışığa duyarlı olduğu için nemli bölmeyi folyo ile sarın. Larvaları, ikincil antikor çözeltisi ile 25 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. İkincil antikor ile inkübasyon tamamlandığında, tamponu her 10 dakikada bir değiştirerek larvaları 30 dakika boyunca bir kez PBT ile durulayın ve larvaları lam üzerine yerleştirmeden önce diseke edilmiş larvaların montajı ve görüntülemesine geçin.

Lamı, diyagramda gösterildiği gibi ortasına, üzerine bir lameli yerleştirmeye yetecek kadar boşluk bırakarak iki dikey oje çizgisi çekip hazırlayın. Ojenin tamamen kurumasını bekleyin. Oje kuruduktan sonra, bu görüntüde gösterildiği gibi lam üzerindeki dikey oje çizgilerinin arasındaki boşluğa bir damla montaj tamponu damlatın.

Lam artık montaj için hazırdır. Son larva PBT işlemini tamamladıktan sonra larvaları geri alın. Durulayın ve yan pinleri larvalardan nazikçe çıkarın.

Kütikülü yırtmamaya dikkat edin. Kalan iki pini çıkarın ve larvayı pensle alarak hazırlanmış lam üzerine yerleştirin. Larvanın ters dönmediğinden ve ventral yönünün yukarı baktığından emin olun.

Kapak camını yavaşça üst kısma yerleştirin ve burada gösterildiği gibi kenarlarını oje ile mühürleyin. Larvalar artık floresan mikroskobunda görüntüleme için hazırdır. Bu temsili görüntü, sinaptik vezikül proteini cystine string proteinine karşı antikorlarla boyanmış vahşi tip bir larvaya aittir.

Lava segmental sinirleri düzgünce boyanmıştır. Burada, bir motor protein mutantı olan lava, CSP'ye karşı antikorlarla boyanmıştır. Segmental sinirler, CSP için parlak boyanma gösteren masif birikimler sergilemektedir.

Bu prosedürü uygularken, beyne bağlı segmental sinirlerin korunduğundan ve kasların sağlam tutulduğundan emin olmak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, diseksiyonun nasıl yapılacağı konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız. Floresan mikroskobu kullanarak aksonal taşınımı incelemek için immün boyama sabitlenmiş üçüncü evre larva segmental sinirlerini hazırlayın.