Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

Bu prosedürün genel amacı, sinir sisteminin bütün mount görüntülemesi için oph ve melanogaster embriyolarını hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle ilgili sinek suşundan embriyoların toplanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, korionun çamaşır suyu ile uzaklaştırılmasıdır.

Prosedürün üçüncü adımı, vilin membranını uzaklaştırmak için heptan ve metanol uygulamaktır. Prosedürün son adımı ise embriyolara antikorlar uygulamaktır. Nihayetinde, immunofloresan mikroskopi aracılığıyla drosophila embriyosu sinir sisteminin yapısını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, mutasyonların gelişmekte olan sinir sisteminde nasıl bir rol oynayabileceği gibi nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, embriyoları yanlışlıkla tüpten dışarı püskürtebildikleri için zorluk yaşayabilirler. Bu protokole P-E-M-F-A, %0,01 sodyum azit salin çözeltili %5 BSA içeren PBC tamponu ve formaldehit fiksatif dahil olmak üzere gerekli olan reaktifleri hazırlayarak başlayın.

Sinekleri karbondioksit ile bayıltarak ve ardından en az 100 sineği, elma suyu agarlı besleme plakası içeren bir adaptöre sahip plastik bir şişeye aktararak ilgili drosophila suşu için bir kafes hazırlayın. Sineklerin bulunduğu kafesi oda sıcaklığında, karanlıkta 72 saat boyunca tutun. Sineklerin kafese alışması ve deney için yumurtalarını tutmamaları amacıyla elma suyu agarlı besleme plakalarını her sekiz ila 12 saatte bir değiştirin.

72 saatlik alışma süresinin ardından, embriyoları elma suyu agar besleme plağındaki son değişimden 12 saat sonra toplayın. Elma suyu agar besleme plağını yumurtlama kafesinden çıkarın ve salin solüsyonu kullanarak değiştirin. Elma suyu agar besleme plağını durulayın.

Embriyoları ince bir süzgeçle toplayın. Plakaya yapışık kalan embriyoları yerinden oynatmak için temiz bir boya fırçası kullanın. Süzgeçteki embriyoları fazla mayayı uzaklaştırmak için salin ile yıkayın; bir spatula yardımıyla embriyoları nazikçe toplayıp küçük bir cam şişeye yerleştirin.

Yaklaşık bir mililitre salin solüsyonu ekleyin. Ardından tüpün kapağını kapatın ve embriyoları yıkamak için beş dakika inkübe edin. Embriyoların toplanmasını takiben.

%50 heptan ve %50 fiksatifu birleştirerek heptan sabitleme çözeltisini hazırlayın. Çözelti, üstte heptan ve altta fiksatif olacak şekilde katmanlaşacaktır. Beş dakika geçtikten sonra, embriyoların bulunduğu cam şişedeki fazla salini uzaklaştırmak için bir pasta pipeti kullanın.

Embriyoların bulunduğu cam tüpe yaklaşık bir mililitre deiyonize su ekleyerek embriyoları durulayın. Suyu %50'lik çamaşır suyu çözeltisi ile uzaklaştırmadan önce embriyoların bir dakika beklemesine izin verin. Tüpü elinizle birkaç kez çalkalayın ve ardından embriyoların kaplanması için üç dakika boyunca inkübe edin.

İşlem görmüş embriyolar tüpün dibine çökecektir. Embriyonik COR'lar yüzeyde kalacaktır. Üç dakikalık inkübasyonun ardından çamaşır suyunu ve COR'ları uzaklaştırın.

Dekorasyon işleminin ardından, embriyoların bulunduğu cam tüpe yaklaşık bir mililitre deiyonize su ekleyerek embriyoları deiyonize su ile iyice durulayın. Suyu boşaltmadan önce embriyoların bir dakika boyunca beklemesine izin verin; kalan COR'lar yüzeye çıkacak ve uzaklaştırılmalıdır. Embriyoların üzerine heptan fiksasyon çözeltisini ekleyin ve fiksasyonu sağlamak için nazikçe çalkalayarak 30 dakika boyunca inkübe edin.

Alt katman olan fiksatifle tıpkı bir makarna pipeti (pasta pipette) kullanarak fiksatifi uzaklaştırın ve tüpte heptanı bırakın. Ardından, fiksatifin yerine tüpün altına tekrar metanol ekleyin, tüpün kapağını kapatın ve vitellin membranı uzaklaştırmak için elle kuvvetlice çalkalayın. Bu adımın ardından, ized embriyolar tüpün dibine çökecektir.

Bir pasta pipeti kullanarak metanolü ve HETS'i vialden uzaklaştırın ve sadece deiyonize embriyoları bırakın. Ardından embriyoları beş kez metanol ile yıkayın ve her yıkama arasında metanolü bir pasta pipeti ile uzaklaştırın. Her yıkama için embriyoları beş dakika inkübe edin.

Embriyoları, yeniden hidrate etmek için %50 PBT çözeltisi ve %50 metanol karışımına beş dakika boyunca yerleştirin. Ardından, embriyoları %100 PBT çözeltisine beş dakika boyunca aktararak rehidrasyon işlemine devam edin. Sonrasında, embriyoları %0,01 sodyum azit içeren %5 BSA çözeltisi içinde dört santigrat derecede bir saat boyunca inkübe ederek bloklayın.

Ardından, primer antikoru %0,01 Sodyum azide içeren %5 BSA çözeltisi ile uygun konsantrasyona seyrelterek embriyo boyama için hazırlayın. Burada kullanılan antikorlar, veziküler sistein dizilimli proteine ve anti HRP antikoruna yöneliktir. Anti HRP, tüm nöronları işaretleyen ve yüzey glikoproteinlerinde bulunan nörona özgü bir karbonhidrat grubunu tanır.

Embriyoları bir gece boyunca dört derece Celsius'ta primer antikor solüsyonu içerisinde inkübe edin. Embriyoları bir saatlik süre boyunca 10 kez PBT ile yıkayın. Embriyoları içeren cam şişeye yaklaşık bir mililitre PBT uygulayarak, PBT'yi uzaklaştırmadan önce embriyoların altı dakika boyunca bekletilmesini sağlayın.

PBT uygulama, inkübasyon ve PBT'nin uzaklaştırılması sürecini 10 kez tekrarlayın. Sekonder antikor çözeltisini, ışığa duyarlı olduğu için uygun konsantrasyonda seyrelterek karanlıkta hazırlayın. Alexa sekonder antikorları 1:200 konsantrasyonda kullanıyoruz.

Embriyoları, sekonder antikor çözeltisi içinde dört derece Celsius'ta iki saat boyunca inkübe edin. Işığa maruz kalmayı önlemek için embriyoların ve sekonder antikor çözeltisinin bulunduğu cam şişeyi alüminyum folyo ile sarın. Embriyoları bir saatlik süre zarfında 10 kez PBT ile yıkayın.

Embriyoları sabitlemek için üzerine vector shield montaj medyumu ekleyin ve dört derece Celsius'ta gece boyu inkübe edin. Embriyoları bir miktar montaj medyumu ile birlikte çekmek için bir pastör pipeti kullanın. Embriyoları ve medyumu bir lam üzerine uygulayın.

Embriyoların üzerine bir lameller kapatın ve lameli oje ile mühürleyin. Embriyoları burada floresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Embriyonik MSS, 16 ila 17. evrelerde gösterilmiştir.

Sistin dizi proteini kırmızı renkle gösterilmiştir. HRP nöronları yeşil renkle gösterilmiştir. Bu temsilci görüntüde komissürün belirgin boyanmasına dikkat ediniz.

Embriyonik PNS, 16 ila 17. evrede gösterilmiştir. Yine, sistin dizisi proteini kırmızı ile, nöronlar ise yeşil ile gösterilmiştir. Periferik nöronların tekrarlayan modellerine dikkat ediniz.

Bu prosedür uygulanırken, embriyoların yanlışlıkla vialden çıkarılmaması için dikkatli olmak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, sinir sisteminin bütün mount görselleştirmesi için oph fla embriyolarının nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.