Gramicidin tabanlı Floresan Testi; çift katlı lipid Özellikleri değiştirmek için Küçük Moleküller Potansiyel Belirleme

Bu prosedürün genel amacı, çift tabaka boyunca uzanan proteinler tarafından algılanan, ilaç kaynaklı çift tabaka özelliği değişikliklerini ölçmektir. Bu işlem, öncelikle floresan yüklü, büyük tek taraflı veziküller oluşturularak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, veziküllerin gramin ile katkılanmasıdır.

Prosedürün üçüncü adımı, harici bir söndürücü eklemek ve dahili fluoro.Four'un sönme hızını ölçmektir. Dördüncü ve son adım ise, floresans zaman seyrine gerilmiş bir üstel fonksiyon uydurarak gramin aktivitesi başına flor sönmesindeki değişimi nicelleştirmektir. Nihayetinde, amfi dosyalarının lipid çift tabaka özelliklerini değiştirip değiştiremediğini değerlendirmek için sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Ola Anderson. Merhaba, ben Helson. Merhaba, ben Richie Kapo.

Ben Leah Sanford, Weill Cornell Medical College Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü'ndeki Dr. Olaf Anderson'ın laboratuvarındanım. Bugün sizlere lipid çift tabaka özelliklerindeki değişimlerin ölçülmesi için kullanılan bir prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, ilaçların ve küçük moleküllerin lipid çift tabaka özellikleri üzerindeki etkilerini incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Bu prosedürün birinci gününde, lipidi dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Oda sıcaklığına ulaştığında, 25 ml'lik yuvarlak tabanlı bir balona 0,6 ml 25 mg/ml lipid ve kloroform çözeltisi ekleyin. Ardından, tüm kloroform buharlaşana kadar balonu sürekli döndürerek çözeltiyi azot gazı altında kurutun.

Lipidlerin ince beyaz bir tabakası balonun tüm alt yarısını kapladığında, lipidleri bir desikatörde vakum altında gece boyunca daha fazla kurutun. 100 millimolar sodyum nitrat, 25 millimolar ANTS ve pH seven 10 millimolar HEPes içeren bir çözelti hazırlayın. Bu çözeltinin pH değerini ayarlarken, klorür içeren çözeltilerden kaçının.

Talyum Söndürücü ikinci günde klorür ile çözünmez bir kompleks oluşturduğundan, lipidleri 1,67 mL elektrolit çözeltisi ile yeniden hidrate ederek 10 milimolar lipid süspansiyonu elde edin. Doğru konsantrasyona ulaşıldığında, parafilm ile kapatın ve süspansiyonu iyice vorteksleyin; örneği folyo ile ışıktan koruyun ve oda sıcaklığında gece boyunca bekletin.

Üçüncü günde, karışımı düşük güçlü bir sonikatörde bir dakika boyunca sonike edin. Ardından, numuneyi beş dakika kuru buzda, sonra beş dakika ılık suda bekleterek dondur-çöz yapın; dondur-çöz döngüsünü dört ila beş kez tekrarlayın. Lipid süspansiyonunu bir Avanti mini ekstrüder kullanarak ekstrüde edin.

Mini ekstrüderi 0,1 mikronluk polikarbonat filtre ve filtre destekleri ile kurun; süspansiyonu, karşı şırıngada neredeyse şeffaf bir süspansiyon oluşana kadar 21 kez ileri geri ekstrüde ederek büyük unilameller vezikül (LUV) süspansiyonu elde edin. Ekstrüde edilen süspansiyonu, sodyum tamponu ile dengelenmiş bir PD 10 desalting kolonundan geçirerek dış NTS'leri uzaklaştırın. Kolona 1,5 mililitre LUV süspansiyonu ve bir mililitre sodyum tamponu ekleyin.

Çözelti kolona tamamen dahil edildikten sonra, lipozomları üç mililitre sodyum tamponu ile elüe edin ve elüatı toplayın. Elde edilen A NTS yüklü LUV stok çözeltisi yaklaşık dört ila beş milimolar lipid içermeli ve yarı saydam, süt beyazı görünümde olmalıdır.

Çözeltiyi folyo ile ışıktan koruyun ve 13 °C'de saklayın; kullanımdan 24 saat önce iyice vorteksleyin. A NTS ile doldurulmuş LUV stok çözeltisi. UUV'lerin yoğunluğu 1 g/mL'den fazla olduğu için çökelme meydana gelebilir.

Ardından, A NTS dolgulu LUV stok çözeltisini sodyum tamponu ile 1:20 oranında seyreltin. Lipozomların dörtte üçünü, DMSO içinde 260 nanogram abidin ile inkübe edin. Kalan dörtte birine, gramin içermeyen aynı hacimde DMSO ekleyin.

Tüm örneklerde solvent konsantrasyonunu sabit tutmak için, graminin lipid veziküllerinin iç ve dış monotabakaları arasında 13 °C'de 24 saat boyunca dengelenmesini sağlayın. Burada, floresan sönümlenme hızını ölçmek için sıcaklık kontrollü bir applied photophysics SX point 20 stopped flows spektroflorimetresi kullanılır. Başlamak için, cihazın ısınmasına izin vermek amacıyla cihazları bir saat önceden açın.

Uyarılma için raporörlü yarık bir bölü bir olmalı ve pro data SX yazılımı kullanılarak emisyon kaydı için 455 nanometre yüksek geçiren filtre kullanılmalıdır. Önce kayıt koşullarını ayarlayın, monokromatör uyarılma dalga boylarını 352 nanometreye ayarlayın. Basınç tutma ayarını kullanın.

Süreyi bir saniye, nokta sayısını ise 5.000 olarak ayarlayın. Tekrar sayısını tampon çalıştırmaları için dokuz, söndürücü çalıştırmaları için 13 olarak belirleyin. Sıcaklığı Essex yazılımındaki sürüş profili kontrolünden izleyin.

Sürücü hacmi, her şırıngadan 60 mikrolitreyi karıştıracak şekilde 120 microliters olarak ayarlanmalıdır. Bu, yaklaşık 1.2 milliseconds değerinde bir ölü zaman sağlar. Floresan dedektöründeki yüksek voltajı veya kazancı yaklaşık 420 volts değerine ayarlayın.

Amaç, yaklaşık sekiz floresans okuması elde etmektir; önceden hazırlanmış A NTS yüklü UUV'leri karanlıkta 25 °C'de 10 dakika boyunca dengeleyin. Dengelendikten sonra örneği vorteksleyin ve ardından sol şırıngaya yükleyin. Sağ şırıngaya ise sodyum tamponu veya thallium.Quencher yükleyin.

Şırıngaları ileri geri iterek hava kabarcıklarını giderin. Her iki şırınga da eşit miktarda doldurulmalıdır. İlk örnek için valfleri kapatmadan önce, sodyum tamponu ile floresansı kaydedin.

Dört kez tekrarlayın ve gerekirse kazancı ayarlayın. Ardından, kalan örnekler için beş kez daha tekrarlayın. Sodyum tamponu ile dokuz tekrar kaydedin.

Sodyum tamponunu talyum söndürücü ile değiştirin ve 13 tekrar kaydedin. Su ile durulayın ve bir sonraki örnek kontrolleri ile devam edin. Gramin içermeyen ve çözücü içeren örneklerin yanı sıra, gramin içermeyen ve maksimum bileşik konsantrasyonuna sahip örnekleri de dahil edin.

Gramin ve çözücü için floresan analizini tamamladıktan sonra, analiz için verileri MATLAB yazılımına aktarın. Okunan her örnekteki tüm tampon ve söndürücü tekrarları için, ilk dört tekrar tüplerde önceden bulunan maddeler tarafından kontamine edilmiş olacaktır. Bu durumda sinyal, sodyum tampon örneğinin önceki yıkamadan kalan suyla karışmasından kaynaklanır.

Beşinci ile dokuzuncu arasındaki tekrarlar yalnızca örnekten gelen sinyali temsil eder. Bu nedenle, her durumda ilk dört tekrarı daima hariç tutarız. Karıştırma kaynaklı artefaktları önlemek için izleri manuel olarak inceleyin ve karıştırma artefaktları ve/veya hava kabarcıkları nedeniyle sapmalar veya pikler içeren kırmızı iz gibi hatalı tekrarları kaldırın.

Ardından, her bir deneysel koşul için her örneğin sönümleyici tekrarlarını, tampon tekrarlarının ortalama başlangıç değerine normalize edin; tüm örneklerin ortalamalarını tek bir grafikte birleştirin; gramin içermeyen görselleştirme örneklerinin tamamı benzer olmalı ve neredeyse hiç floresan sönümü göstermemelidir. Gramisidin içeren örnekler için, talyum iyonlarının veziküllere yavaşça girmesi nedeniyle floresan sinyalinde yavaş bir azalma meydana gelir. Eğer floresan zaman seyri bileşik tarafından gözle görülür şekilde değiştirilmişse, bu durum bileşiğin test edilen konsantrasyonda lipid çift katman özelliklerini değiştirdiğini gösterir; ardından, normalize edilmiş floresan sönümü eğrilerinin ilk 2 ila 100 milisaniyelik kısmına genişletilmiş bir üstel fonksiyon uydurun.

Bireysel tekrarlar için iki milisaniyedeki hızı hesaplayın. Ardından, verilen bir örnek için bireysel tekrarlardan ortalamaları ve standart sapmaları hesaplayın. Burada cap olarak belirtilen kapsaisinin etkisi, ga olarak belirtilen graminin yokluğunda veya varlığında floresan sönümlenme zaman seyri üzerinde gözlemlenmiştir; normalize edilmiş floresan sinyali burada bir saniyelik süre boyunca gösterilmiştir. Gri noktalar tüm tekrarlardan elde edilen sonuçları, kırmızı çizgiler ise ortalamaları temsil etmektedir.

Normalize edilmiş floresan sinyalinin ilk 100 milisaniyesi gösterilmiştir. Gri noktalar, her bir koşul için tek bir tekrarın sonuçlarını temsil etmektedir. Kırmızı çizgiler, bu tekrarlara uygulanan genişletilmiş üstel uyumlardır.

Kesikli mavi çizgi, iki milisaniyelik noktayı belirtmektedir. Bu nokta, sönümleme hızının belirlendiği zamandır. Sönümleme hızındaki göreceli değişim, verilerin gramin içeren ve modifiyer içermeyen kontrol örneğine normalize edilmesiyle belirlenir.

Kapsaisin lipid çift tabakasına absorbe olduğunda, çift tabaka özelliklerini değiştirir. Daha yumuşak bir çift tabakaya doğru gerçekleşen bu değişim, mono-dimer dengesinin gram tarafında, iletken dimer lehine bir kayma olarak yansıyacaktır. Size az önce, küçük bir molekülün çift tabakayı bozucu etkilerini ölçmek için kullanılan bir prosedür gösterdik.

Bu prosedürü uygularken, her deney için aynı vezikül grubunu kullanarak uygun kontrollerin kullanıldığından emin olmak önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.