GIRK Kanal Modülatörler belirlenmesi için Floresan Tarama Testi
24 Nisan 2012
G-protein bağımlı içe düzeltici K ile etkileşim ilaçların belirlenmesi için gerçek zamanlı tarama yöntemi + (GIRK) kanalları açıklanmıştır. Tahlil GIRK kanal aktivitesini ölçmek için membran potansiyeli duyarlı floresan boyalar kullanır. Bu teknik, hücre serileri bir dizi kullanım için uyarlanabilir.
Bu prosedürün genel amacı, grk kanallarını modüle eden yeni ilaçların belirlenmesidir. Bu işlem, öncelikle A TT 20 hücrelerinin 96 kuyucuklu plakaya ekilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, test bileşiklerinin Verset sıvı plaka işlem sistemi kullanılarak seyreltilmesidir.
Ardından, seyreltilmiş test bileşikleri verset kullanılarak hücrelere uygulanır. Son adım, 96 kuyucuklu plakanın Synergy two floresan plaka okuyucuya yerleştirilmesi ve kontrol ile somatostatin çözeltilerinin kuyucuklara enjekte edilmesidir. Nihayetinde, floresan plaka okuyucu, somatostatin tarafından indüklenen floresan sinyalini değiştiren ve böylece Grk kanallarını modüle eden bileşikleri göstermek için kullanılır.
Bu prosedürün patch clamp kaydı gibi mevcut yöntemlere göre avantajı, gerk kanallarını modüle edip etmediklerini belirlemek için çok sayıda bileşiğin hızlı bir şekilde taranabilmesidir. Bu tekniğin etkileri, FI nosiseptif iletiminin inhibisyonuna yol açan ve Gerk kanalını aktive eden bileşiklerin tanımlanabilmesi sayesinde ağrı tedavisine kadar uzanmaktadır. 96 kuyucuklu plakaların kaplanması ve hücrelerin ekilmesi prosedürünü Maribel Vasquez göstermektedir.
Laboratuvarımdaki bir öğrenci bu prosedüre, pituitary A TT 20 hücrelerini %10 at serumu ile desteklenmiş DMEM içerisinde, %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde, 37 degrees Celsius'ta büyüterek başlar. Standart bir izolyasyon prosedürü kullanarak hücreleri her beş ila yedi günde bir alt kültüre alarak kültürü sürdürün. Ardından, siyah şeffaf kuyucukları kaplayın.
96 kuyucuklu plakanın tabanını 50 µL poly L lysine ile kaplayın. Kuyucukların inkübatörde 30 dakika boyunca kurumasına izin verin. Ardından fazla poly L lysine'i uzaklaştırın ve hücreleri, her kuyucukta 200 µL besiyeri olacak şekilde 30.000 hücre/kuyucuk yoğunluğunda 96 kuyucuklu plakaya ekin.
Ardından hücreleri üç ila dört gün boyunca inkübatörde saklayın. Kültür ortamını hücre monotabakasından yavaşça aspire etmek için bir aspirasyon düzeneği kullanın, ardından hücreleri 200 µL normal tampon çözelti ile yıkayın. Sonrasında, her birine membran potansiyeline duyarlı boya içeren 200 µL tampon çözelti ekleyin.
Hücreleri 37 °C'de 40 dakika boyunca inkübe edin. 40 dakika sonra, ATT 20 hücrelerini inkübatörden çıkarın, oda sıcaklığına dönmelerini bekleyin ve eski tamponu aspire edin. Ardından, hücrelere MPD içeren taze tampon çözeltisini uygulayın.
Ardından, test bileşiklerinin ve kontrol çözeltilerinin çeşitli konsantrasyonlarını hücrelere uygulamak için sıvı taşıma sistemini kullanın. Floresan ölçümleri öncesinde, hücreleri 96 kuyucuklu plakada test bileşikleriyle birlikte beş dakika boyunca inkübe edin. Bu prosedürde, 96 kuyucuklu plağı bir biotech synergy two floresan plaka okuyucuya yerleştirin.
520 nanometre eksitasyon dalga boyunda ve 560 nanometre emisyon dalga boyunda floresan arka plan sinyalini elde edin. Ardından, Synergy two injektör sistemini kullanarak GIR kanallarını aktive etmek için kuyucuklara G PCR R ligandlarını veya kontrol çözeltisini uygulayın. Daha sonra 302 saniyelik bir örnekleme süresi boyunca on saniyelik aralıklarla veri noktalarını toplayın.
Uyarılma ve emisyon dalga boylarında. Analizin güvenilirliğini belirlemek için Z faktörünü hesaplayın. 0,5 ile 1,0 arasındaki Z faktörleri, analizin kalitesinin mükemmel olduğunu gösterir.
Z faktörleri 0,5'in altında olan plaklar hariç tutulmuştur. Analiz sonucunda floresan sinyali modüle eden bileşikler, içe doğru doğrultucu potasyum kanalı özgünlüğünü doğrulamak amacıyla 2 millimolar baryum klorür veya 500 nanomolar terapin Q varlığında yeniden test edilmiştir; burada somatostatin veya kontrol çözeltisinin eklenmesiyle ATT 20 hücrelerinde zamanla ölçülen temsili bir HLB 0 2 1 1 15 2 floresan sinyali gösterilmektedir. Y eksenindeki floresan yoğunluğu oranı, somatostatin veya kontrol çözeltisi varlığındaki sinyalin, somatostatin veya kontrol çözeltisi eklenmeden önce ölçülen bazal sinyale bölünmesiyle hesaplanmıştır.
Burada, A TT 20 hücrelerinin 500 nano molar Terapin Q ile tedavisi gösterilmektedir. Terapin Q, iki G kanalına bağlanıp bunları bloke ederek somatostatin aracılı floresan sinyal azalmasını inhibe eder. Burada ise, somatostatin aracılı floresan sinyal azalmasını yine inhibe eden 20 mikromolar propafenon ile A TT 20 hücrelerinin tedavisi gösterilmektedir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde işlem iki saatte tamamlanabilir.
Bu videoyu izledikten sonra, floresan plaka okuyucu kullanarak grk kanallarını modüle eden ilaçların nasıl tanımlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, G proteini kapılı içe doğru doğrultucu K + (GIRK) kanallarıyla etkileşime giren ilaçları belirlemek için kullanılan gerçek zamanlı bir tarama prosedürünü açıklamaktadır. Analiz, GIRK kanalı aktivitesini ölçmek için membran potansiyeline duyarlı floresan boyalar kullanır ve bu sayede çeşitli hücre hatlarına uygulanabilir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Farmakoloji
- Nörobilim
- Elektrofizyoloji
Arka Plan
- GIRK kanalları, nöronal sinyalleşmede kritik bir rol oynar.
- GIRK kanallarının modülatörlerinin belirlenmesi, yeni terapötik stratejilere yol açabilir.
- Gerçek zamanlı analizler, ilaç tarama verimliliğini artırır.
- Floresan boyalar, kanal aktivitesinin hassas bir ölçümünü sağlar.
Çalışmanın Amacı
- GIRK kanallarını modüle eden ilaçların taranması için bir prosedür geliştirmek.
- Birden fazla bileşiği test etmek için yüksek kapasiteli bir format kullanmak.
- GIRK kanalı farmakolojisi hakkındaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- 96 kuyucuklu plakaya TT 20 hücrelerinin ekilmesi.
- Test bileşiklerini seyreltmek için Verset sıvı transfer sistemi kullanımı.
- Seyreltilmiş bileşiklerin Verset ile hücrelere uygulanması.
- Yanıtları ölçmek için Synergy two floresan plaka okuyucu kullanımı.
Ana Sonuçlar
- Somatostatin ile indüklenen sinyalleri değiştiren bileşiklerin tanımlanması.
- Analizin çeşitli hücre hatlarına uyarlanabilirliğinin gösterilmesi.
- Test edilen bileşikler tarafından GIRK kanal aktivitesinin başarılı bir şekilde modülasyonu.
- Floresan plaka okuyucunun taramadaki etkinliğinin doğrulanması.
Sonuçlar
- Geliştirilen analiz, GIRK kanallarını hedefleyen ilaç keşfi için değerli bir araçtır.
- Gerçek zamanlı tarama, potansiyel terapötiklerin tanımlanmasını hızlandırabilir.
- Tanımlanan bileşiklerin klinik etkilerini araştırmak için ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bu analiz, nörobilim ve kardiyovasküler ilaç keşfinde hedef doğrulamayı destekleyerek, GIRK kanal modülatörlerinin yüksek kapasiteli tanımlanmasına olanak tanır. Gerçek zamanlı ve kantitatif floresan okumalar sağlayarak, düşük kapasiteli elektrofizyoloji yöntemlerine olan bağımlılığı azaltır ve hit-to-lead (başlıktan öncü bileşiğe) ilerleme sürecini hızlandırır. Yöntem, bileşik etkilerini fizyolojik olarak ilgili bir hücresel bağlamda fonksiyonel kanal aktivitesiyle ilişkilendirerek, erken keşif aşamasındaki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: GPCR ligandlarına yanıt olarak fonksiyonel GIRK kanal modülasyonunu ölçerek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Mekanistik özgüllüğe sahip aktivatörlerin veya inhibitörlerin belirlenmesi için bileşik kütüphanelerinin hızlıca taranmasına olanak tanır.
- Öngörücü Değer: K+ efleksi ile ilişkili floresan sinyal değişiklikleri üzerinden hedef üzerindeki aktiviteyi doğrulayarak hedef riskini azaltmayı destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: GIRK aktivasyonu üzerine ölçülebilir, gerçek zamanlı sinyaller üretmek için membran potansiyeli duyarlı boyalar (DiBAC4(3) veya HLB 021-152) kullanılır.
- Tekrarlanabilirlik: Z-faktörü hesaplaması (mükemmel aralık: 0,5–1,0), hit seçimi ve kampanya tekrarlanabilirliği için analiz sağlamlığını garanti eder.
- Ölçeklenebilirlik: Otomatik bileşik dağıtımı ve tarama için 96 kuyucuklu format ve sıvı aktarım sistemleri (örneğin, Verset) ile uyumludur.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: Belirlenen modülatörler, GIRK aracılı nöronal inhibisyon yoluyla nöropatik ağrı, bağımlılık ve kardiyak aritmiler için terapötik stratejilere bilgi sağlayabilir.
- Translasyonel Süreklilik: Floresan okumalar, hedef etkileşiminden fonksiyonel çıktıya bir köprü kurarak preklinik fenotip sabitlemesini destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: GIRK aracılı etkileri hedef dışı aktiviteden ayırt etmek için baryum klorür veya Terapin Q gibi inhibitörler kullanılarak özgünlük doğrulanmıştır.
İş Akışı ve Hat Entegrasyonu
Bu analiz, hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürecine uygundur ve GIRK modülatörlerinin alt süreç optimizasyonundan önce fonksiyonel olarak taranmasına olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: GPCR aktivasyonunu GIRK bağımlı floresan değişiklikleriyle ilişkilendirerek hipotez testlerini destekler ve yolak modülasyonuna açıklık getirir.
- Tarama: Standartlaştırılmış boya yüklemesi, bileşik uygulaması ve 300 saniye boyunca gerçekleştirilen kinetik floresan ölçümü ile assay hazırlığı sağlar.
- Analitik: Bileşik potensinin ve etkinliğinin karşılaştırılmasına olanak tanıyan nicel bağımlı değişken ölçümleri (floresan yoğunluk oranları) üretir.
- Translasyonel Araştırma: Ağrı ve bağımlılık modelleriyle ilgili olarak, GIRK aracılığıyla nöronal eksitabiliteyi değiştiren bileşikleri tanımlayarak preklinik çalışmalarla bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Hücre hatları ve GPCR ligandları genelinde platforma uyarlanabilir, böylece birden fazla hedef doğrulama kampanyasında yeniden kullanıma imkan tanır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: İyon kanalı ilaç taramasındaki mekanistik belirsizliği azaltarak hedef modülasyonunda öngörücü güven sağlar.
- Operasyonel Değer: Bitiş nokta analizleriyle elde edilemeyen standartlaşma, tekrarlanabilirlik ve gerçek zamanlı kinetik veriler sunar.
- Stratejik Değer: Erken fonksiyonel doğrulamaya olanak tanıyarak, hedef etkileşim eksikliğinden kaynaklanan geç aşama başarısızlık riskini azaltır ve devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Onaylanmış GIRK aktivitesine sahip bileşiklerin, lead optimizasyonuna geçiş için riskle uyumlu şekilde önceliklendirilmesini kolaylaştırır.
Uygulama Hususları
- Hücre kültürü (AT T20 hücreleri), floresan boya kullanımı ve kinetik plaka okuyucu işletimi konularında uzmanlık gerektirir.
- Enjeksiyon kapasitesine sahip bir floresan plaka okuyucuya (örneğin, Synergy 2) ve uyumlu eksitasyon/emisyon ayarlarına (520 nm/560 nm) bağımlıdır.
- Kuyucuklar ve plakalar genelinde boya yüklemesinin, inkübasyon sürelerinin ve tampon koşullarının standartlaştırılmasını gerektirir.
- Diğer hücre hatlarına adaptasyon, GIRK ekspresyonunun ve boya yükleme verimliliğinin doğrulanmasını gerektirir.
- Pratik sınırlama: GIRK kaynaklı olmayan floresan değişimlerini dışlamak için assay özgüllüğü, ortogonal inhibitörler (örneğin, Ba2+, Terapin Q) kullanılarak doğrulanmalıdır.
