Civciv Embriyolar Tek Hücreli Transfeksiyon

Bu prosedürün genel amacı, civciv somitlerinden veya nöral tüplerden tek hücrelere, yeşil floresan protein kodlayan bir plazmit enjekte etmektir. Bu işlem, öncelikle uygun uç açıklığı çapına sahip mikroenjeksiyon pipetlerinin çekilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise enjeksiyonlar için bir plazmit stok çözeltisi hazırlamaktır.

Prosedürün üçüncü adımı, embriyoların enjeksiyon için hazırlanmasıdır. Prosedürün dördüncü adımı, mikro pipetlerin plazmid DNA ile doldurulmasıdır. Prosedürün son adımı ise istenilen dokulara enjeksiyonun yapılmasıdır.

Sonuç olarak, immünofloresan mikroskopi aracılığıyla, seçilen somit ve nöral tüp alt alanlarında tekli işaretlenmiş progenitörler tarafından üretilen hücre sayısındaki türev yelpazesini gösteren veriler elde edilebilir. Merhaba, ben Kudüs İbrani Üniversitesi Tıbbi Nörobiyoloji Bölümü'nden Profesör Heim'in laboratuvarından Rael. Bugün size tavuk somitleri ve nöral tüplerine tekli hücre enjekte etme prosedürünü göstereceğiz.

Bu prosedürü laboratuvarda, somite ve nöral tüp hücrelerinin hat ayrışmasını çalışmak için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Civciv embriyolarında tekil transfekte hücreler üretmek için, mikro pipetleri çekerek işe başlayın. Pipetlerimizi, 13,5 ısı ayarına sahip standart bir Naga PP 83 pipet çekici ile çekiyoruz.

Pipet ucu çapının 8 ile 10 mikron arasında olması için hassas ayar kalibre edilmelidir. Dış çapı bir milimetre, iç çapı 0,75 ile 0,78 milimetre olan borosilikat cam tüpler içeren filamentler kullanıyoruz. Ayrıca, dış çapı bir milimetre ve iç çapı 0,75 milimetre olan bir filamanı bulunmayan, ticari olarak temin edilebilen mikro pipetleri de kullanabilirsiniz.

Hazırlanan pipetler, uçları kabın kenarıyla temasa geçmeyecek şekilde plastik bir kapta saklanır. Mikroenjeksiyon için DNA'yı hazırlamak amacıyla, ilgili plazmit DH5α E. coli'ye transfekte edilir. Ertesi gün standart prosedürler kullanılarak plazmit, Maxi prep kiti ile saflaştırılır; klonal olmayan enjeksiyonlar için 1 µg/µL DNA konsantrasyonu kullanılır.

Tekil klonların istendiği deneyler için plazmit konsantrasyonu çok daha düşük olacaktır ve ayarlanması gerekecektir. P-C-A-G-G-F-P-A için µL başına 0,05 ila 0,1 µg konsantrasyon iyi sonuç verir. Optimal konsantrasyon belirlendikten sonra, tekil hazırlıklar yerine tüm saflaştırılmış plazmit stokunun önceden belirlenmiş bir konsantrasyona seyreltilmesini öneririz.

İkincisi, muhtemelen saflıktaki farklılıklar ve süperkıvrımlı plazmid oranı gibi diğer parametreler nedeniyle başarı oranlarında bazı varyasyonlara yol açabilir; mikroenjeksiyon için tavuk yumurtalarını hazırlamak amacıyla, istenen gelişim aşamasına gelene kadar uzun eksenleri üzerinde yatık halde inkübe edilen yumurtalar %70 etanol ile silinir ve kurumaya bırakılır. Ardından, yumurtanın sivri ucu cerrahi makasla delinir. 10 mililitrelik bir şırınga ve 19 gauge iğne kullanarak yumurtadan iki mililitre albümin çekilir ve enjeksiyondan önce delikler sıcak parafinle mühürlenir.

Kalıntıların deliğe girmesini önlemek için cerrahi makas kullanarak yumurta kabuğunun üst kısmında bir pencere açın. Pencerenin üzerine bir parça bant yerleştirin ve bant üzerinden bir delik açın. Embriyoyu daha iyi görüntülemek için, blastodermal tabakanın altına pelican 17 gibi toksik olmayan bir mürekkep enjekte etmek amacıyla bir aspiratöre monte edilmiş, ateşle çekilmiş bir kapiler kullanın.

Ardından, DNA'yı çekilmiş Eloqua pipetine yüklemek için iğne tutucuya sabitlenmiş 0,14 milimetrelik böcek iğneleri kullanarak vitellin ve/veya amniyotik membranları kesip kenara çekerek embriyoya erişin ve kapiler yardımıyla az miktarda fast green tozu ekleyin. Uygun çaplı bir kapilere monte edilmiş minimal miktarda plazmidi bir aspiratöre çekin. Ardından, bunu pipetin sivri ucunun karşısındaki ucundan yerleştirin ve DNA'yı sivri uca mümkün olduğunca yakın bir noktaya yükleyin.

Ardından, pipeti bir mikro manipülatöre monte edilmiş manuel hava basınçlı enjektöre takın. Plazmit solüsyonunun pipetin ucuna ulaşmasını sağlamak için gerekirse minimum miktarda basınç uygulayın. Pipet ucunun tıkanmasını önlemek için bir miktar hava basıncı uygularken, pipeti yumurtanın sıvı ortamına doğru yönlendirin.

İlgili doku alanı delindikten sonra, basınç değişimi genellikle görünür hızlı yeşil boyalı plazmidi salmak için yeterlidir. Eğer bu gerçekleşmezse, plazmid hızlı yeşil karışımı dışarı püskürtülene kadar şırıngaya hafifçe basınç uygulayın. Bu işlemi embriyonun ekseni boyunca tekrarlayın; enjeksiyondan sonra PBS eklenebilir.

Son olarak, pencereyi yapışkan bantla kapatın ve yumurtaları inkübatöre geri yerleştirin. Havalandırmadan kaçının ve nemi korumaya yardımcı olmak ve verimi artırmak için inkübatöre küçük su kapları yerleştirin. Enjeksiyonun hedef bölgesi, dorsal somitler nöral tüpü veya ektoderm gibi kolayca fark edilebilecek kadar yüzeysel ise, floresan binoküler kullanarak bütün mont gözlemi yaparak deneyin başarı oranı ölçülebilir.

Bu adım, çok fazla veya çok az hücrenin işaretlenip işaretlenmediğini değerlendirmek için özellikle faydalıdır. Daha fazla inkübasyon isteniyorsa, inceleme sonrası yumurtaya PBS çözeltisi içeren antibiyotikler ekleyin ve tavan bandını yeniden yerleştirin. Ayrıca, embriyoların seri kesitleri alınarak ve immünohistokimya uygulanarak enjeksiyonun başarı oranı değerlendirilebilir.

Enjeksiyondan dört saat veya daha fazla süre sonra embriyolar fikse edilir ve parafin kesitleme için işlenir. Cam slaytlara monte edilen kesitler daha sonra deparafine edilir ve raporlayıcı görselleştirme için immünboyama yapılır; biotin streptavidin gibi amplifikasyon yöntemleri tercih edilebilir. Son olarak, enjekte edilen segmentlerdeki işaretli hücreleri tespit etmek için seri kesitler taranır.

İlk denemelerde tek hücreler yerine birden fazla hücre elde edilirse, plazmit stoku seyreltilmeli ve yeterli sonuçlar alınana kadar işlem tekrarlanmalıdır. Genellikle, embriyo başına altı ila 12 segmenti hedefleyerek, her somiteye tek bir P-C-A-G-G-F-P enjeksiyonu gerçekleştiriyoruz. Bu düzenleme altında, enjeksiyondan sekiz saat sonra, 10 embriyodan birinin en az bir segmentinde, bütün mount gözlemi ile net bir sinyal tespit edilebilmektedir.

Bu örnekte, bir so mite'ına GFP kodlayan bir plazmid enjekte edilmiş ve beş saat sonra burada gösterilen embriyonun bütün mount görünümünde tek bir floresan hücre gözlemlenmiştir. Merkezi so mite'ına yapılan enjeksiyondan 24 saat sonra gözlemlendiğinde, klonal enjeksiyondan iki gün sonra bütün mount edilmiş bir embriyoda floresan hücrelerden oluşan bir klon görülmektedir. Bu segmentin kesit alınması, hem dermis hem de kas dokusunda klonal progenitörlerin varlığını ortaya koyarak, tekil progenitörlerin her iki türevi de oluşturduğunu kanıtlamaktadır.

Somitlere benzer şekilde, bu enine kesitte gösterildiği üzere, dorsal nöral tüpteki tekil nöroepitelyal progenitörler de impale edilebilir; burada fotoğraf, enjeksiyondan beş saat sonra çekilmiştir. Seri kesit analizi, başarı oranının yaklaşık %10 olduğu durumlarda klonal transfeksiyonların elde edildiğini ortaya koymuştur. Bu, klonaliteye ulaşmak için tekniğin tanım gereği oldukça verimsiz olduğu anlamına gelir. Öte yandan, bu koşullar altında, pozitif etiketleme olaylarının %93'ünden fazlasının klonal olduğu saptanmıştır.

Bu prosedürü uygularken tavuk embriyolarının tek hücrelerine nasıl enjeksiyon yapılacağını göstermiş olduk. Büyük miktardaki stok plazmidi, tek hücre enfeksiyonları için ideal bir konsantrasyona seyreltmeyi ve ardından deneyleriniz boyunca bu konsantrasyonu kullanmayı hatırlamanız önemlidir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.