DNA Fragments Electroeluting

Merhaba. Bugün size, sindirim ve PCR ürünleri gibi DNA fragmanlarını saflaştırmak için elektro elüsyonun nasıl gerçekleştirildiğini göstereceğiz. Klonlama ve dizileme gibi ileri amaçlar için elektro elüsyon, tercih edilen yöntemlerden biri olabilir. DNA'nın negatif elektrik yüküne dayanarak, elektro alana yüksek bir hücre bariyeri yerleştirilir; bu durum fragmanların çökelmesini sağlar ve daha fazla migrasyonlarını engeller.

Bu yöntem, farklı kaynaklardan geniş bir DNA fragman boyutu aralığının %80'e varan nispeten yüksek bir verimlilikle saflaştırılmasına olanak tanır. Düşük maliyeti, kolonlar ve reçine kitleri gibi diğer saflaştırma yöntemleriyle karşılaştırıldığında elektro-elüsyonun bir başka avantajını oluşturur. DNA örneği, saflaştırılacak istenen fragmanın görselleştirilmesi ve tanımlanması amacıyla öncelikle etidyum bromür ile boyanmış agaroz jel elektroforezi ile görüntülenir; ardından elektroforez işlemine devam edilmelidir.

Fragmanlar iyi ayrıştırıldığında, boyutun küçük olduğu kesin olarak belirlenebilir. Elektroforezi takiben, istenen fragman, yeni bir jilet kullanılarak ve jel dilimi ilgi duyulan banda mümkün olduğunca yakın döndürülerek jelden özenle kesilip çıkarılır.

Bu prosedür, UV ışığından uygun şekilde korunarak ve eldiven giyilerek gerçekleştirilmelidir. Elektrolüter uygun yıkama tamponu ile doldurulup tamponun orta plakanın yüzeyine taşmasına dikkat edildikten sonra, jel dilimi tekerleklerden birinin içine, V kanalına mümkün olduğunca yakın olacak şekilde yerleştirilir. V kanalının içinde hava kabarcığı bulunmamalıdır.

Hapsolmuş havayı uzaklaştırmak için kanalın tamponla yıkanmasıyla bu durum önlenebilir. Ardından, yüksek tuzlu bariyerden 100 microliters, kuyucuğa yakın konumdan V kanalına dikkatlice eklenir. Hazne kapatılır ve 100 ila 120 volt değerinde elektrolüsyonu başlatmak için elektrotlar güç kaynağına bağlanır.

Zaman aşımı, 20 kb'ye kadar olan büyük fragmanlar için fragman boyutuna bağlı olacaktır. 50 dakika ile bir saat arası yeterli olmalı ve küçük fragmanlar, tuz çözeltisi üzerinden son adult buffer zincirine daha fazla elüsyonu önlemek için UV ışığı ile her 10 dakikada bir izlenmelidir. Bu durumda, 900 baz çiftlik bir fragman açığa çıkarmak için 560 nanogram plazmidi ND one ve entry enzimleri ile sindirdik; bu, 84 nanogramlık bir örneğe eşdeğerdir.

Buna göre, jel dilimi kuyuya yerleştirildikten sonra, 100 volt değerinde 25 dakika boyunca elektroelüsyon işlemi gerçekleştirilir. Elektroelüsyon tamamlanıp DNA fragmanları V kanalındaki alt yastıkta toplandığında, kanalın hazne distal tarafından 400 µL çözelti geri kazanılır ve bir mikropipete takılı ince uç kullanılarak 1,5 µL'lik bir mikrotüpe aktarılır; ardından iki hacim soğuk absolut etanol eklenip vorteksle karıştırılarak alkol çöktürme işlemine geçilir. Ek olarak, DNA geri kazanım verimini artırmak için iki ila üç µL glikojen eklenebilir. Tüpler -20 °C'de bir saat boyunca veya alternatif olarak bu sıcaklıkta gece boyunca bekletilir, ardından 4 °C'de maksimum hızda 25 dakika boyunca santrifüj edilir.

Bu süpernatantı ve yıkama işlemini bir mililitre soğuk, %70 etanol ekleyerek gerçekleştirin. Dört santigrat derecede, maksimum hızda beş ila 10 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı uzaklaştırın ve tüpler ters konumdayken oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Pelletleri 10 ila 15 mikrolitre nükleazsız su içinde resüspande edin ve numunenin konsantrasyonunu belirleme işlemine geçin. Bu durumda, saflaştırılmış numune 10 mikrolitre suda resüspande edilmiş ve 260 nanometre dalga boyundaki bir spektrofotometrede miktar tayini yapılmıştır; sonuçlar %75 verimliliği temsil eden 6,3 nanogram/mikrolitre konsantrasyon göstermiştir. Değerli vaktinizin sadece 10 dakikasını bir kit ile harcamanın daha iyi olabileceğini düşünüyor olabilirsiniz.

Buna rağmen, bu süreçte harcanan zamana karşın, doğaları gereği farklı boyut ve kaynaklara sahip daha geniş bir örnek yelpazesini saflaştırmanıza olanak tanıyan birçok değişkeni kontrol edebileceksiniz. Mevcut durumda gördüğünüz üzere, çoğu DNA saflaştırma kitiyle eşit veya onlardan daha iyi olan %75 verimlilik gözlemlenmiştir. Bugün bize katıldığınız için teşekkür ederiz.

Bu protokolün araştırma projeleriniz için faydalı olduğunu umuyoruz.