Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yeni floresan DNAzim probları kullanarak E. coli gibi spesifik bakterilerin varlığını hızlı bir şekilde tespit etmektir. İlk olarak, genik DNAzim probları ligasyon yoluyla üretilir. Ardından, hedef molekül sayısını artırmak için bakteriler kültüre alınır ve supernatanttan hücre dışı karışım hazırlanır.

Ardından, ham hücre dışı karışım DNA zim probu ile birleştirilir; DNA zim probu ile hedef moleküller arasındaki etkileşim, probun parçalanmasıyla sonuçlanır ve ardından prob floresan yayar. Prob ve hedef arasındaki etkileşim, bir florimetre kullanılarak bağıl floresan artışı olarak gözlemlenir. Sonuçlar daha sonra denatüre poliakrilamid jel elektroforez analizi kullanılarak doğrulanır.

Bu tekniğin PCR veya antikor tabanlı yöntemlere göre temel avantajı, prosedürün daha basit ve uygulanmasının daha kolay olmasıdır. Bu yöntem model bakteri e coli ile geliştirilmiş olsa da, diğer tüm gıda kaynaklı veya nozokomiyal bakteriyel patojenlerin saptanmasında uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, sentetik DNA problarının ve bakterilerin kullanımıyla ilgili deneyimleri olmadığı için başlangıçta zorluk çekebilirler. Bu protokol için prosedürü, laboratuvarımdan araştırma asistanı Sergio Aguire ve doktora sonrası araştırmacı Monso Ali göstermektedir.

Öne çıkan DNA Zyme, R-F-D-E-C one'dır. Bu yapı, siyahla altı çizili olan katalitik EC one dizisi ile yeşil ile altı çizili olan substrat FS one dizisinden oluşur; substrat içerisinde mavi r ile belirtilen bir RNA bağı, F ile belirtilen Flor işaretli bir DT ve queue ile belirtilen bir SÖNDÜRÜCÜ (QUENCHER) işaretli DT bulunur. RF SS one, katalitik EEC one dizisinin kısmen SS one içine karıştırıldığı, ancak FS one kısmının değişmeden kaldığı RFD EEC one'ın randomize edilmiş (scrambled) bir versiyonudur. R-F-D-E-C one için hedef olarak kullanılacak ham hücre dışı karışımları (CEM'ler) hazırlamak amacıyla RF DEC one ve RF SS one, LT one ligasyon şablonunun varlığında, oligonucleotid FS one'ın oligonucleotid EC one veya SS one ile şablon aracılı enzimatik ligasyonu yoluyla üretilir. İşleme, bir pipet tabancası kullanarak steril 14 mL'lik kültür tüplerine 2 mL LB dağıtarak başlayın.

Ardından, steril bir pipet ucu kullanarak, bir agar plakadan tek bir e coli kolonisi alın ve bunu LB içeren bir kültür tüpüne aktarın. Tüpleri 37 °C'ye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin ve inkübasyon sonrası 14 saat boyunca 250 RPM'de çalkalayın. %1'lik bir inokülasyon kültürü oluşturmak için, 14 ml'lik kültür tüplerine iki mililitre taze LB dağıtın ve önceki adımdan elde edilen bakteriyel kültürden 20 µL ekleyin.

Tüpleri, her bir bakteri solüsyonu yaklaşık bir OD 600 değerine ulaşana kadar 37 °C'de 250 RPM sallama ile inkübe edin. Her kültürden bir mililitre yeni bir 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri 11.000 G'de beş dakika santrifüjleyerek çöktürün. Santrifüj işleminden sonra berrak süpernatantı taze bir 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Süpernatantı -20 °C'de saklayın. DNA enzimlerinin ham hücre özütü ile etkileşimi sonucu floresan sinyal oluşup oluşmadığının belirlenmesi için hemen kullanılmayacaksa, numuneler spektrofotometre ile analiz edilir. Floresan spektrofotometreyi açın ve veri toplama parametrelerini 488 nm eksitasyon ve 520 nm emisyon olarak ayarlayın.

Ayrıca, cihazı bir saat boyunca her dakika okuma yapacak şekilde ayarlayın. Üç adet kuvars kristal küveti önce distile deiyonize suyla, ardından %100 etanol ile yıkayın. Küvetleri azot gazı püskürterek kurutun.

Küvetleri kontrol bir için C1, kontrol iki için C2 ve test için T olarak etiketleyin; ardından C1'e 24 µL distile deiyonize su, C2 ve T'ye ise hazırlanan e coli ham hücre dışı karışımından 24 µL aktarın. Her küvete 25 µL 2X RB ekleyin ve küvetleri floresan spektrofotometreye yerleştirin. Beş dakika sonra floresans verilerini toplamaya başlayın, floresans okumalarının kesilmediğinden emin olarak C2'ye 1 µL 5 µM RFS S1, T ve C1'e ise 1 µL 5 µM RFD eec1 ekleyin. Her çözeltiyi pipetleme yoluyla karıştırın, ardından reaksiyonun veri toplama süresinin geri kalanında devam etmesine izin verin.

Verileri Excel dosya formatında kaydedin. Ardından verileri bir kişisel bilgisayara aktarın ve grafiksel bir görüntü oluşturmak için Excel'i kullanın. Spectra ile analiz için kullanılan reaksiyon karışımlarının aynısıdır.

Fotometri, jel elektroforez ile analiz için kullanılabilir. Bir saatlik kazanım süresinin ardından, küvetleri spektrofotometreden çıkarın ve çözeltileri yeni mikro santrifüj tüplerine aktarın.

Beş mikrolitre 3 M sodyum asetat ve 125 mikrolitre %100 etanol ekleyerek reaksiyonları durdurun. Her bir çözeltiyi vorteksleyerek karıştırın ve inkübasyon sonrası santrifüj öncesinde tüpleri -20 °C dondurucuda bir saat bekletin. Reaksiyon karışımlarını 4 °C'de 20 dakika boyunca 11.000 G'de santrifüjleyin ve süpernatantı pipetleme yoluyla dikkatlice uzaklaştırın.

Peletleri bir DNA konsantratörü kullanarak 10 dakika boyunca kurutun. 20 µL jel yükleme tamponu ekleyin ve kısa süreliğine vorteksleyin. Masaüstü santrifüj ile kısa süreliğine çöktürün.

Ardından, çalışma tamamlandıktan sonra %10'luk Dage jelinin her kuyucuğuna 10 µL reaksiyon örneği yükleyin. Cam plakaları çıkarın ve musluk suyuyla iyice yıkayın. Kalan jel parçalarını temizlemek için plakaları bir Kim wipe ile silin.

Typhoon tarayıcı kullanarak jel plakayı floresan için tarayın. Sistemin hassasiyetini değerlendirmek için ortaya çıkan görüntüleri görüntü miktar belirleme (quant) yazılımı ile analiz edin. Seri dilüsyonlu kültürler, artan zaman aralıklarında büyütülür.

Tek bir bakteriyi tespit etmek için gereken minimum inkübasyon süresini belirlemek amacıyla, iki mililitre LB içeren 10 kültür tüpü hazırlayın; her bir kültürü, E. coli gliserol stokundan mililitre başına 2 CFU içeren 100 mikrolitre ile inoküle edin ve 37 °C'de, 250 RPM hızında çalkalayarak 4, 8, 12, 16 ve 24 saat boyunca inkübe edin. 4, 8 ve 12. saatle ilgili zaman noktalarında hasat edilen örneklerde tespit edilebilir bakteri bulunmayabileceği için, inoküle edilen kültür tüplerinin her birinden 300 mikrolitre hasat edin.

Bakteri içeren kültürleri belirlemek için kalan kültürün 24 saat boyunca büyümesine izin verin. OD 600 değerini ölçün ve hücreleri 11, 000 G'de beş dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün. CEMS içeren süpernatanı taze 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın ve ertesi gün kullanana kadar minus 20 degrees Celsius'ta saklayın.

Kültürlerde büyüme olup olmadığını kontrol edin. İnokülasyon sonrası 10 kültürden sadece bir veya ikisi E. coli içerebilir ve geri kalan tüplerde herhangi bir hücre bulunmayacaktır. Belirlenen zaman noktalarında pozitif kültürlerden geri kazanılan CEMS'leri kullanarak RFD EEC one ile kesim reaksiyonları hazırlayın ve reaksiyon karışımlarını daha önce açıklanan DAGE jel elektroforezi ile analiz edin; hem RFD EEC one hem de RF SS one probları, DNAzim kısımlarının substrata enzimatik ligasyonu ile hazırlanmıştır.

CEM EEC ile RFD EEC veya RF SS arasındaki etkileşim daha sonra spektrometri ile değerlendirilmiştir. Burada görülebileceği üzere, CEM ec eklenmesi üzerine R-F-D-E-C yüksek düzeyde floresan sinyali üretmiştir.

Buna tam tersine, R FS S one güçlü bir floresan sinyali üretmedi. Böylece RFD EEC one'ın floresans üreten fonksiyonu, CEM EC ile temas ettiğinde dizilenir.

Gözlemlenen floresan artışlarının RNA bağının kopmasından kaynaklandığını doğrulamak için spesifik bir işlem yapılmıştır. Reaksiyon karışımları, RFD eec'nin dage koparılmasıyla analiz edilmiştir; 0,25 molar sodyum hidroksit ile işlem yapıldığında, biri floresanı tutan beş prime fragmentı ve diğeri susturucuyu tutan üç prime fragmentı olmak üzere iki RNA fragmentı oluşması beklenir. Burada görülebileceği gibidir.

RFD EEC CEM EEC reaksiyon karışımı gerçekten beklenen parçalanma ürününü oluşturdu. Dahası, sadece UNC, R-F-D-E-C'yi parçaladı ve beş-prime fragmanı floresan görüntüleme ile tespit edilebildi. RFD EEC'nin özgünlüğünü incelemek için, yalnızca diğer çeşitli gram-negatif ve gram-pozitif bakterilerden toplanan CEMS kullanılarak floresan analizleri gerçekleştirildi.

CEM EC içeren örnekte floresan artışı gözlemlenmiştir. Diğer bakterilerden elde edilen CEMS ile çapraz reaksiyon görülmemesi, R-F-D-E-C one'ın E. coli için yüksek derecede seçici olduğunu göstermektedir. Tek bir E. coli hücresini tespit etmek için gereken minimum kültür süresini belirlemek amacıyla, mililitre başına bir CFU olacak şekilde seyreltilmiş E. coli, 100 µL büyüme ortamında 4, 8, 12, 16 ve 24 saat boyunca kültüre edilmiştir. Elde edilen CEMS'ler R-F-D-E-C one ile karıştırılmış ve burada gösterildiği gibi DAG-E ile parçalanma durumu değerlendirilmiştir.

Dage testi görüntüsü, R-F-D-E-C birincisinin beklenen kesim ürününü oluşturmadığını göstermektedir. CEM ile reaksiyona girdiğinde, büyümenin dördüncü ve sekizinci saatlerinde toplanan ECS'ler, yöntemde uzmanlaşıldığında 12 saatlik kültür süresinin gerekli olduğunu göstermektedir.

Bu tekniğin temel bileşeni, bu gelişmeden sonra doğru şekilde uygulandığında DA enzim tabanlı analizin 60 dakika içinde tamamlanabilmesidir. Bu prosedür, biyoanaliz alanındaki araştırmacıların geniş bir yelpazedeki bakteriyel patojenlerin tespiti için allojenik DNA enzimlerini keşfetmelerinin önünü açmıştır.