Kapalı Kranial Pencere kullanarak Fare Beyin Mikrosirkülasyon intravital Mikroskopi

Bu prosedürün genel amacı, pile mikrodolaşımındaki hemodinamik ve inflamatuar belirteçlerdeki dinamik değişikliklerin uzun süreler boyunca takip edilmesine olanak tanıyan intravital mikroskopi ile fare beynindeki mikrodolaşımı incelemektir. Bu teknik, birçok farklı çalışma türü için kullanıldığı La Jolla Bioengineering Institute'da geliştirilmiştir. Örneğin; Plasmodium berghei ANKA enfeksiyonu seyri sırasındaki hemodinamik değişikliklerin ve serebral malarya ekspresyonu anındaki durumun takibinde kullanılmıştır.

Bu işlem, öncelikle intravital mikroskopi çalışmalarından iki hafta önce kronik bir kraniyal pencerenin implante edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, düşük büyütmede yüksek çözünürlüklü dijital bir görüntü kullanarak kraniyal pencerenin genel morfolojisinin kaydedilmesidir. Prosedürün üçüncü adımı ise konvansiyonel ve floresan aydınlatma kullanarak intravital mikroskopi görüntülerinin elde edilmesi ve damar çapı ile RBC hızının çevrimiçi ölçümleri için spesifik çalışma bölgelerinin seçilmesidir.

Prosedürün son adımı, floresan işaretli spesifik antikorlar aracılığıyla pil vasküllerindeki lökosit ve trombosit yapışmasının intravital analizini gerçekleştirmektir. Nihayetinde, beyin intravital mikroskobu aracılığıyla, bu durumlarla ilişkili hemodinamik değişiklikleri saptamak için fizyolojik, patofizyolojik veya hastalıklı durumların cerebral aynalama modellerinde in vivo mikrodolaşım değişikliklerini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin temel avantajı, beyni dış ajanlara veya yapifürel ortamlara maruz bırakmadan kendi fizyolojik ortamında gözlemlememizdir; intravital mikroskopi, manyetik rezonans görüntüleme ve anjiyografiye kıyasla mekansal ve zamansal çözünürlüklere sahiptir ve mikroskobik düzeyden daha mikroskobik düzeylere bakmamıza olanak tanır.

Bu yöntem, akut ve kronik hastalıklar sırasındaki hemodinamik ve inflamatuar değişiklikler gibi beyin mikrosirkülasyonunun fizyolojisi ve patofizyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. İntravital mikroskopi öncesindeki iki ila üç hafta içinde, sekiz ila 10 haftalık farelerde daha önce gösterildiği şekilde, hayvanın kafasına titanyum bar yerleştirilmediği hariç bir kraniyotomi gerçekleştirilir. Kronik kranial pencere, implantasyonun üzerinden aylar geçse dahi deney gününde pil mikrosirkülasyonunun incelenmesine olanak tanıyan stabil bir preparattır.

Önceden hazırlanmış floresan işaretli eritrositleri farenin kuyruk veninden enjekte edip hayvanı stereotaksik çerçeveye yerleştirmeden önce, ilk olarak hayvanın vücut sıcaklığını kontrol edin. Bu işlem, daha sonra gösterilecek olan eritrosit takibini mümkün kılacaktır. Ardından, fareyi izofluran ile hafifçe anesteziye alın.

İndüksiyon için %4, idame için %1 ila %2. Ardından, hayvanı bir ısıtma pedi üzerinde, stereotaksik çerçevede yüzüstü pozisyona getirin. Kulak barlarını kullanarak başı dikkatlice sabitleyin ve sağ ve sol kolları kullanarak seviyeyi ayarlayın.

Kraniyal pencere üzerindeki lamelini, mineral yağı ile nemlendirilmiş bir pamuklu çubukla nazikçe temizleyin. Ardından, dijital bir kameraya bağlı stereo mikroskop kullanarak, pencerenin altındaki damarların birkaç panoramik fotoğrafını çekin. Panoramik fotoğrafları bir bilgisayara aktardıktan sonra, yazdırılacak, tanımlanacak ve tarih atılacak olan en iyi fotoğrafı seçin.

Bu fotoğraf, intra vital mikroskobiye başlamak için bir sonraki adımda gösterilecek olan damar çapı ve kırmızı kan hücresi hızlarının ölçümleri için bir harita olarak kullanılacaktır. Fareyi özelleştirilmiş bir intravital mikroskop tablasına aktarın. Dental akrilik tarafından oluşturulan kuyucuktan yararlanarak kranial pencere üzerine bir damla su damlatın.

Sayısal açıklığı 0,5 olan 20x su daldırma objektifi kullanılır. Görüntüler iki kamera ile kaydedilir: bir bilgisayara ve monitöre bağlı dijital düşük ışıklı, yüksek hızlı kamera ile bir VCR kasedine, zaman damgasına ve renkli monitöre bağlı düşük ışıklı analog kamera. Ölçüm için damarlar seçilmeden önce, preparatın kalitesini değerlendirmek için damarlar kontrol edilir ve tüm damarlarda kan akışı mevcutsa, ölçülecek damarlar seçilir. Seçilenler, farklı çaplardaki ven ve arterleri içermeli ve pencere tarafından açılan alandaki farklı konumları kapsamalıdır.

Deneyimizde, kranial pencere içindeki çeşitli alanları incelerken ölçüm yapmak için 12 damar seçiyoruz. Damarları seçmek için, daha önce çekilmiş olan PY vaskülarizasyon fotoğrafında ölçülecek her bir noktanın kesin konumunu işaretleyin; her bir nokta için damar çapı bir görüntü kaydırma (image shear) cihazı kullanılarak ölçülür. Nokta seçildikten sonra, damarın görüntüsü dikey konuma getirilir ve görüntü zıttına kadar kaydırılır.

Uç noktalar hizalanır ve okuma kaydedilir. Eritrosit takibi için, her nokta dijital kamera ile en az 30 saniye boyunca kaydedilir ve video görüntüleri saniyede 150 kare hızında kaydedilir. Bu hız, saniyede altı milimetreye kadar olan hızların belirlenmesi için tek bir video karesinde bir hücrenin bir ila altı görüntüsünü elde edecek şekilde ayarlanmıştır.

Veri toplama işlemi tamamlandığında, fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın ve uygun yazılımı kullanarak anesteziden ayılması için kafesine geri koyun. Elde edilen video görüntüleri dijitalleştirilir ve her bir hücre görüntüsü için XY.Koordinat verileri elde edilir. Hücre konumları, görüntü analizi yerine manuel olarak belirlenir.

Eğitimli bir gözlemcinin gözünün, genellikle gözlemlenen maksimum floresan konumuna karşılık gelen hücre merkezinin konumu hakkında iyi bir tahmin sağladığı göz önünde bulundurulmuştur. Çoğu hücre yönelimi için, her damarda 15 hücrenin konum ve hız belirlemeleri yapılır. Damar çapı ve RBC hızı ölçümleri elde edildikten sonra, ortalama RBC hızını bulmak için bir ortalama hesaplama yapılır.

Her bir damardaki kan akışının hesaplanması, Q eşittir D bölü iki kare çarpı PI çarpı V formülü kullanılarak yapılabilir; burada Q kan akışını, V RBC hızını ve D, perfüzyon değerlendirmesi ve pile damarlarındaki lökosit yapışmasının analizi için damar çapını temsil eder. İntravital mikroskopi, FSE işaretli albümin ve Texas Red ile işaretlenmiş pan lökosit belirteci CD 45'e karşı antikorların karışımı infüze edilmiş bir hayvanda gerçekleştirilir. Floresan işaretli albümin, penetran damarlar da dahil olmak üzere vasküler ağın daha iyi görüntülenmesini sağlar ve özellikle serebral malaria gibi hastalık durumlarında perfüze olmayan veya düşük perfüzyonlu damarların kontrol edilmesi için kullanışlıdır.

Floresan işaretli anti CD 45 antikorları, lökosit yuvarlanmasının ve pile damarlarına yapışmasının tanımlanmasını ve miktarının belirlenmesini kolaylaştırır. Lökosit yapışmasının nicelendirilmesi, 100 mikronluk damar uzunluğundaki lökosit sayısının sayılmasıyla yapılır. Yuvarlanma ise, aynı 100 mikronluk uzunlukta 30 saniye boyunca kan hızından önemli ölçüde daha yavaş hızda hareket eden lökositlerin sayısı sayılarak nicelendirilir. Gösterilmiştir.

Burada, yüksek hızlı floresan görüntülemeden hücre takibi yoluyla yapılan mikrovasküler kırmızı kan hücresi hız ölçümlerine bir örnek verilmiştir. A'dan F'ye kadar olan video kayıt görüntüleri, mikrosirkülasyonun ardışık görüntüleridir. Her bir resim, yüksek hızlı kamera tarafından kare kare yakalanan, akan tek bir kırmızı kan hücresinin konumunu temsil eder.

Temsili bir deneyden alınan bu grafik, zaman içindeki pile kan akışındaki değişimleri göstermektedir. Plasmodium berghei ANKA ile enfekte olan farelerde ve enfekte olmayan kontrol farelerinde, kontrol farelerinde pile kan akışı zaman içinde nispeten sabitken, PBA enfekte fareler serebral malaria gelişimi sırasında kan akışında belirgin bir azalma göstermektedir.

Altıncı günde, anti CD 45 Texas red floresan antikorlarla yapılan boyama, plasmodium burgi onca ile enfekte edilmiş bir farenin pilus damarlarına yapışmış çok sayıda lökositi ortaya çıkarmaktadır. Bu prosedür, bugün burada gösterilen işlemin ötesinde geniş bir uygulama alanına sahiptir. In vivo olarak kullanılabilecek her türlü optik teknik bu modele uyarlanabilir ve doku, doku oksijen seviyesi, pH, reaktif oksijen türleri ve lökositlerin endotel ile etkileşimi gibi parametreler bu modelde incelenebilir.