Kranial Pencere üzerinden neokorteks Kan Akış 2-Foton Görüntüleme Bir Yöntem

Yaşayan kemirgenlerin sağlam beyninde serebral vaskülatürün görüntülenmesi ve kan akış dinamiklerinin kaydedilmesi yeteneği, serebral iskemi veya normal beyin fizyolojisinin incelenmesinde uygulanabilecek güçlü bir tekniktir. Burada, kuyruk venine enjekte edilen floresan boyalar kullanarak yaşayan farelerin neokorteksindeki kan akış dinamiklerini görüntülemek için iki foton mikroskopisinin nasıl kullanılacağını göstereceğiz. Bu teknik orijinal olarak David Kleinfeld ve Winfred Dank tarafından geliştirilmiştir.

Merhaba, ben California Üniversitesi Los Angeles Nöroloji Bölümü'ndeki Carlos Porter Cayo Laboratuvarı'ndan Ricardo Mota. Önceki bir videoda, in vivo kronik görüntüleme deneyleri için kraniyal pencere implantasyon yöntemini göstermiştik. Bugün size, kraniyal pencere aracılığıyla serebral korteksteki kan akış dinamiklerinin görüntüleme prosedürünü göstereceğiz.

Bu hazırlık, iki foton lazer mikroskopisi kullanarak beynin derinliklerinin görüntülenmesine olanak tanıdığı için oldukça kullanışlıdır. Öyleyse başlayalım. Serebral vaskülatürü görüntülemek için hayvanlara intravenöz olarak floresan bir boya enjekte edilmelidir.

Dekstran motifi boyanın kan-beyin bariyerini geçmesini ve kan damarlarından sızmasını önlediği için dekstran konjuge boyalar kullanıyoruz. Fareler, indüksiyon için %4 ve enjeksiyon sırasında %1,5 ila %2 izofluran ile anestezi altına alınır. Ardından, kuyruk %70 alkollü üç pamukla dezenfekte edilir ve 26 gauge iğne ile salinde çözünmüş %5'lik Rhodamine Dextran çözeltisinden 75 ila 100 µL kuyruk veninden enjekte edilir.

Kuyruk şaftının orta kısmından, kuyruk ven enjeksiyonunun hemen ardından, boya idrarla atılana kadar görüntüleme yapılabilir; ERO domine boya kullanıldığında idrar pembe renge dönecektir. Floresan Dexter boya enjeksiyonunu takip eden yaklaşık iki saat içinde, fare isoflorür ile anestezi edilir. İndüksiyon için %4, görüntüleme için %1 ila %1,5 kullanılır. Fare, hayvanı sıcak tutmak için termal düzenlemeli bir ısıtma pedi içeren mikroskop tablasına titanyum bar kullanılarak sıkıca sabitlenir.

Gözleri nemli tutmak için bir miktar göz merhemi uygulanır. Kraniyal pencerenin lameli %70 alkol ile temizlenir. Pencere, odak düzlemine paralel olarak konumlandırılır ve görüş alanının merkezine yerleştirilir.

4x objektif altında, beyin yüzey damarlarının dijital bir kamera ile fotoğrafının çekilmesi en uygunudur. Bu fotoğraf, sonraki görüntüleme oturumlarında görüntü bölgesini günden güne tekrarlanabilir şekilde bulmak için referans görüntüsü olarak kullanılacaktır. Ardından 4x objektif, su daldırma 40x objektif ile değiştirilir.

Sahne hareket ettirilmeden, görünümün dijital görüntüsü alınır. Sahne manipülatörünün koordinatları tekrar sıfıra ayarlanır. Görüntüleme yazılımı olarak scan image kullanılır.

Bu, Carls Voto'nun laboratuvarında Tom Paul Rudo ve Bernardo Sabatini tarafından MATLAB'de yazılmıştır. Ardından lazer, güç ölçer, fotomultipliyer tüpler, amplifikatörler vb. diğer tüm ekipmanları açıyoruz. En uygun bölgeleri belirlemek için görüntülenecek pencere alanı düşük büyütmede kısaca taranır.

Bunlar belirlendikten sonra, görüntülenecek seçili bölgenin düşük büyütmeli yığını alınır ve küçük damarlardaki veya kılcal damarlardaki kan akış dinamiklerini kaydetmek için XY koordinatları not edilir. İlgilenilen damar boyunca en az 40 mikron uzunluğunda hat taramaları (line scans) kullanıyoruz. Bir saniye süren bu tekil taramalar, mümkün olan en düşük lazer gücü kullanılarak gerçekleştirilir; tarama koordinatları ve açısı kaydedilir.

Görüntüleme oturumu sona erdiğinde, hayvanın anesteziden etkilerinin geçmesi için sıcak bir bölmeye alınması sağlanır. Burada, kuyruk veninden r Domine dekstran enjekte edilen beş aylık bir fareyle, somatosensör korteks üzerine yerleştirilen kranyal pencere aracılığıyla iki foton mikroskobumuzla her beş mikronda bir çekilen yüz görüntülük bir yığın sunuyoruz. Bu görüntü dizisi, kılcal damarlar da dahil olmak üzere, büyük ve küçük kan damarlarının oluşturduğu karmaşık ağı göstermektedir.

Size, kraniyal pencere aracılığıyla in vivo kan akış dinamiklerinin görüntülenmesi için bir yöntem gösterdik. Bu, örneğin inme sonrası kan akışındaki değişiklikleri araştırmak amacıyla kortikal vaskülatürdeki serebral kan akış dinamiklerini görüntülemek için son derece güçlü bir yöntemdir. Floresan boyanın kuyruk venine tekrarlayan enjeksiyonları kullanılarak, BUL'lerde çeşitli zamanlarda çok sayıda görüntüleme yapılabilir.

Bu prosedürü uygularken, mümkün olan en temiz ve en steril koşullarda çalışmaya özen göstermek ve ellerin çok sabit olması önemlidir. Tamam, işte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneyinizde başarılar dileriz.