Tüm Yaprak Görüntüleme kullanarak Bakteriyel Hücreler Live Stoma Tepki Değerlendirilmesi

Bu prosedürde, canlı bakteri hücrelerine yanıt olarak bekçi hücre hareketini değerlendirmek için yaprak görüntüleme yöntemi kullanılır. İlk olarak, bakteriler gliserol stoktan kültüre edilir ve bir inokülüm hazırlanır. Ardından, genç ve sağlıklı yapraklar toplanır ve propidyum iyodür ile boyanır.

Boyanmış yapraklar kesilir ve yaprak parçaları bir bakteri süspansiyonunun üzerinde inkübe edilir. Son olarak, yaprak yüzeyi mikroskop altında incelenir ve stomatal açıklıklar ölçülebilir. Floresan mikroskobu kullanılarak elde edilen sonuçlar, bakterilere yanıt olarak stomatal açıklıktaki değişimleri göstermektedir.

Bu yöntemin epidermal soyulma gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bakterilerle temas eden yaprağın sağlam olması ve böylece bakterilerin yapraklara nüfuz etmesi için doğal koşulların taklit edilmesidir. Bu prosedüre başlamak için, Arabidopsis tohumlarını; yetiştirme ortamı, vermikülit ve perlitin 1:1:1 hacimsel oranındaki karışımına ekin. Bitkileri bir büyüme odasında yetiştirin ve gerektiğinde sulayın.

Bitkiler, sapa kalkma öncesinde genç ve tamamen genişlemiş yapraklara sahip oldukları dört ila altı hafta içinde kullanıma hazır hale gelir. Deneye başlamadan iki gün önce bakteri kültür çizgisi hazırlayın. Pseudomonas ringe'yi gliserol stoktan modifiye LB besiyerine ekim yapın ve 28 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin.

İnokülumu hazırlamak için taze kültür kullanın ve kültür plaklarını her zaman gliserol stoklarından başlatın. Bakteriler alt kültürleme sonrası daha az virülan hale geldiğinden, 10 mililitrelik bir Pseudomonas singe sıvı kültürü başlatmak için plak üzerinde büyümüş bakterileri kullanın. Kültürü, 600 nanometredeki optik yoğunluk veya od değeri 0,8 ile 1 arasına ulaşana kadar 50 mililitrelik bir erlenmeyer flaskında, 28 °C'de kuvvetli çalkalamayla gece boyunca inkübe edin.

600 nm'de OD değerini ölçün ve hücreleri 1.360 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüj ederek toplayın. Hücreleri, final OD değeri 0.2 olacak şekilde distile su içinde yeniden süspande edin. Bu OD değeri, mililitre başına 10⁸ koloni oluşturan birime karşılık gelir.

Bakteriler hazır olduğunda, yaprakları hazırlama aşamasına geçin ve yaprakları boyamak için deneyi gerçekleştirin. İlk olarak, suda 20 µM propidyum iyodür veya PI çözeltisi hazırlayın. 10 mL çözelti, aynı anda üç küçük yaprağı boyamak için yeterlidir.

Bitkileri büyüme odasından çıkarın ve penset yardımıyla üç adet genç, tam gelişmiş yaprağı koparın. Yaprakların tamamını beş dakika boyunca PI çözeltisine batırın. Ardından yaprakları çıkarın ve distile su ile kısaca durulayın.

Ardından, bir yaprağı alt yüzeyi aşağı gelecek şekilde bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Bakterilerin yapraklarla inkübe edilebilmesi için yaprağın lam üzerinde düz durmasını sağlamak amacıyla, orta damarı hariç tutarak yaprağı keskin bir jiletle dört parçaya bölün. Lam üzerindeki yaprak parçalarının altına 300 µL bakteriyel süspansiyon ekleyin; yaprağın alt yüzeyinin inokulumla temas ettiğinden emin olun.

Numuneleri, bitkilerin büyütülmesinde kullanılan çevresel koşulların aynısında inkübe edin. Yaprakları mikroskop altında gözlemleme zamanı geldiğinde, yaprak parçalarını alt yüzeyleri yukarı bakacak şekilde yeni bir lama aktarın. Lamların hazırlanması sırasında lamel kullanılmadığını unutmayın.

Aynı yaprak örneği inkübasyon sırasında birden fazla kez görüntülenebilir ve araştırma amaçlarına göre bir zaman serisi oluşturulabilir. Burada, yaprakları incelemek, aynı yaprak örneklerini kullanarak PI floresansını tespit etmek için yaprakların alt yüzeyini gözlemlemek ve stomaların zaman içindeki görüntülerini yakalamak için bir lazer taramalı konfokal mikroskop kullanılır. Stomatal açıklık genişliğini ölçmek için görüntüleri kaydedin.

Her zaman noktasında, her işlem için en az 60 stomanın açıklık genişliğini ölçün. LSM görüntü tarayıcısını kullanarak, stomaların açıklık genişliği için ortalama ve standart hatayı hesaplayın. Sonuçların istatistiksel anlamlılığı, çift kuyruklu eşleştirilmiş ikili Student's t-testi kullanılarak hesaplanabilir.

Bu, lazer taramalı konfokal mikroskop altında bir arabidopsis yaprak yüzeyinin tipik bir mikroskobik görüntüsüdür. Brightfield görünümünde, propidyum iyodür canlı hücrelerin hücre duvarını boyayarak, hasarsız hücrelerin tanımlanmasına olanak sağlamasının yanı sıra bekçi hücrelerin görünürlüğünü artırır. Bu mikrograflarda, tamamen kapalı stomalardan genişçe açık stomalara kadar çeşitli stomatik açıklıklar görülebilir.

Tamamen kapalı stomalar, bekçi hücrelerinin şekli ile tanımlanır. Açık stomalar için açıklık genişliği sıfır mikrometre olarak kabul edilir. Gösterilen açıklık genişliği, stoma gözeneklerinin en geniş alanı boyunca çizilen düz bir çizgi kullanılarak ölçülür.

Bunlar, canlı yaprak inokülasyon analizinin tipik deneysel sonuçlarıdır. Arabidopsis yaprakları, üç farklı Pseudomonas şubesi ile karanlıkta inkübe edilmiş; her bakteri şubesi başına rastgele seçilen 60 stomadan ölçülen açıklık genişliğine göre, yalnızca P-S-T-D-C 3000 bakterisi karanlık stomaları açabilmiştir. Bu teknik, bitki-bakteri etkileşimleri alanındaki araştırmacıların, bitki türlerinde patojenlere karşı erken yanıt mekanizmalarını keşfetmelerinin yolunu açmıştır.