Görüntüleme için Basit Bir Yöntem Arabidopsis Infiltratif Görüntüleme Orta Perfluorodecalin kullanarak bırakır.

Bu prosedürün genel amacı, yaprak içindeki canlı hücrelerin daha net görüntülerini elde etmek için bitki yapraklarındaki hava boşluklarının neden olduğu biyolojik görüntü bozulmalarını en aza indirmektir. Yaprak sulu bir montaj ortamına yerleştirildiğinde ve bir florofor lazerle uyarıldığında, dokuda turuncu ile gösterilen birçok boş hava alanı ve kırılma indisi değişiklikleri, sonuç görüntüsünde dokunun derinliklerinden gelen sinyalin gücünü sınırlar. Yaprak bunun yerine perflorodekalin (PFD) içine yerleştirilirse, floroforun lazerle uyarılması daha az sönümlenir ve yayılan sinyallerin daha iyi iletilmesini sağlar.

Sonuç olarak, PFD montaj ortamı ile birlikte taramalı lazer konfokal mikroskobun kullanımı, bitki yaprağı içindeki canlı hücrelerin, sulu bir montaj ortamı kullanıldığında mümkün olanın iki katından fazla derinlikte net görüntülerini sağlar. Bu tekniğin, yaprakların fikse edilmesi veya montajlanması ve sulu ortamlar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, mezofil içindeki kırılmayı azaltması ve yaprağın daha derinlerinde yer alan, görüntülenmesi sorunlu olan canlı hücrelerin daha doğru şekilde görüntülenmesine olanak tanımasıdır. Bu yöntem; mezofil, hücre biyolojisi ve in vivo sinyal iletimi ile patojenlerin yaprakları kolonize etmesi ve patojen-konak etkileşimleri gibi bitki bilimindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve temel bitki biyolojisine dair içgörü sağlayabilir.

Bu yöntem ayrıca, iç kulak spiralleri veya omurgalı akciğeri gibi hava boşluğu bakımından zengin olan diğer yüksek kırılma indisli dokulara da uygulanabilir. Bu prosedürü laboratuvarımdan Dr. George Littlejohn uygulamalı olarak gösterecektir. PFD'deki örnekler, polidimetilsiloksan veya P-D-M-S'den yapılmış gaz geçirgen bir contaya sahip bir mikroskop lamı hazırlanarak başlar; P-D-M-S, deneysel gereksinimlere göre özelleştirilmiş bir hazne sağlamak için kalıplanabilen viskoelastik bir polimerdir.

Hava dolu bir şişede az miktarda PFD'yi çalkalayarak PFD'yi hava ile dengeleyin. Bu işlem, PFD içinden hava kabarcıkları geçirerek de gerçekleştirilebilir; ardından PFD'yi açık bir Petri kabına boşaltın ve bütün bir fideyi veya kesilmiş bir yaprağı beş dakika boyunca sıvının üzerinde yüzdürün. Doku, vitrifiye dokuyu anımsatacak şekilde yarı saydam hale gelmelidir.

Işıklandırma koşullarına ve kullanılan dokunun yaşına bağlı olarak, yapraklar PFD'ye maruz kalmadan öncesine göre daha koyu veya daha açık görünebilir. Son olarak, PDMS haznesini aero equate edilmiş PFD ile doldurun ve doku örneklerini inkübasyon Petri kabından PDMS haznesine dikkatlice aktarın. Lamı bir kapatma lamı ile mühürleyin ve görüntüleyin.

Deneysel gereksinimlere göre, aylık yapraklar beş dakika boyunca rekombinant yeşil floresan protein veya GFP süspansiyonunda inkübe edilmiştir. PFD mikroskobik incelemesinde, PFD ile inkübe edilen yaprak örneklerinin çoğundaki hava boşluklarının PFD içinde süspande olmuş rekombinant GFP ile dolduğu görülmektedir. GFP yeşil renktedir; kırmızı renk ise klorofili, otofloresansı ve mezofil hücrelerini temsil etmektedir.

PFD ile inkübasyon sonrası yaprağın tamamen sıvıyla dolduğu, ancak yer yer hava boşluklarının kalabildiği görülmektedir. Bu koşullar altında su, yaprağı tamamen doldurmaz. Burada, sitozole yerleşen bir YFP varyantı olan Venus eksprese eden opsys yaprakları; hava, su veya PFD içinde inkübe edilerek monte edilmiş ve lazer taramalı konfokal mikroskopiye tabi tutulmuştur. Örneklerin konfokal mikroskobu, görüntüleme derinliğinde yaklaşık iki katlık bir artışla PFD'nin hava ve suya göre avantajlı olduğunu göstermektedir.

PFD ve su karşılaştırıldığında, bu teknik bir kez kavrandıktan sonra uygun şekilde uygulandığı takdirde beş ila 10 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, perifloro-dekalinin oje ve teflonu çözdüğünü ancak silikon gresi ile uyumlu olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, bitki yaprak hücrelerinde görüntülemeyi iyileştirmek için bir montaj ortamı olarak perifloro-dekalinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Perfluoro decalin toksik olmasa da, bu prosedürü gerçekleştirirken standart güvenlik uygulamalarının benimsenmesini öneririz.