Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA'lar ve microRNA, Profilleme

Bu prosedürün genel amacı, qPCR tabanlı dizilerin hızlı ve güvenilir bir şekilde otomatik kurulumuna olanak sağlamaktır. Bu işlem, öncelikle dizi için primer setlerinin hazırlanması ve taranacak örnek ana karışımlarının (master mix) kurulmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, örnek ana karışımlarını ve primer setlerini 384 kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa doğru şekilde aktarmak için ya otomatik bir robotik PCR kurulumu ya da bir matris elektronik pipet sistemi kullanılır.

Hazırlandıktan sonra, 384 kuyucuklu PCR reaksiyonları light cycler four 80 tabanlı PCR programı ile yürütülür. Prosedürün son adımı, QPCR verilerini analiz etmek ve her biri belirli bir mRNA'yı hedefleyen test edilen her primer çifti için göreceli ekspresyon seviyelerini belirlemektir. Nihayetinde, geniş mRNA setlerinin ekspresyonundaki değişimleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu nedenle, özel olarak geliştirilmiş diziler, qPCR tabanlı profilleme yoluyla tüm pre-mikro RNA profillerini, belirli yolakları veya viral enfeksiyon için kritik olan molekülleri hedefleyebilir. Merhaba, ben North Carolina Üniversitesi Chapel Hill Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'nden Dirk DMA. Bugün size gerçek zamanlı qPCR kurulumunun nasıl yapılacağını göstereceğiz ve size iki farklı yöntem sunacağız.

Biri düzensiz pipetle, diğeri ise bir robot kullanılarak. Bu teknolojiyi, insan tümörlerindeki pre-microRNA'ları ve olgun microRNA'ları ölçmek için kullanıyoruz. Bugünkü gösterim Pauline Chu ve Kristen bu tarafından gerçekleştirilecektir.

Hadi başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, -20 °C'de saklanan, 96 kuyucuk formatında 0,5 pM konsantrasyonda 186 primer çifti içeren primer plakalarını çıkarın.

Plakalar oda sıcaklığında çözdürüldükten sonra, kısa süreliğine vorteksleyin ve santrifüjleyin. Ayrıca, her bir 96 kuyucuklu primer plağının kurulumu için oda sıcaklığında cyber green two times PCR mix çözdürün; dört adet master mix tüpü gerekecektir. Her bir 2 mL'lik eppendorf tüpünde, reaksiyon başına 4 µL cyber green mix, 3 µL PCR sınıfı su ve 10 ila 20 ng örnek DNA veya cDNA birleştirerek master mix'i hazırlayın.

Her tüp, pipetleme kayıpları için fazlalık payı bırakılarak, yaklaşık 100 reaksiyon için yeterli master mix içermelidir. Karıştırmak için tüpleri vorteksleyin. Robotun başlatılması ve EVO wear programının yüklenmesiyle birlikte, freedom Tecan EVO robotunu kullanarak öncül mikro RNA analizi kurulumuna başlayın.

Ardından, pipetleme doğruluğunu etkileyecek hava kabarcıklarını sistemden temizlemek için robotu 30 mililitre sistem sıvısı ile üç kez yıkayın. Sonra, robot platformunu bir 384 kuyucuklu plaka ve 96 kuyucuklu primer plakası içerecek şekilde hazırlayın. Master mixler için %2 çamaşır suyu içeren bir oluk, dolu bir sistem sıvı kabı ve boş bir atık kabı yerleştirin.

Programın sonundaki çalıştır (run) seçeneğine iki kez tıklayarak otomatik robot işlemini başlatın. 384 kuyucuklu plakayı çıkarın ve light cycler four 80 tavan folyosu ile mühürleyin. Ardından plakayı santrifüjleyin.

Kapatılmış 384 kuyucuklu plakayı hızlıca otelin birinci konumuna yerleştirin. Ardından, yeni master mix'ler ve yeni bir 384 kuyucuklu plaka ile aynı işlemi ikinci primer plakası için tekrarlayın. Elde edilen kapatılmış 384 kuyucuklu plakayı otelin ikinci konumuna yerleştirin.

Hotelden ışık döngüleyiciyi yüklemek için yeni bir EVO wear programı açın ve döngü parametrelerini ayarlayın. Ardından iki kez çalıştır seçeneğini belirleyin. Freedom Evo, her plakayı otomatik olarak ışık döngüleyiciye yükleyecek ve cyber green HRM döngü programını çalıştıracaktır.

İşlem tamamlandığında, sonuçları robot kullanmaya alternatif olarak yazılı protokolde açıklandığı şekilde inceleyin ve analiz edin. Master mix tüpü birinin içeriğini bir rezervuara aktarmak için matris elektronik çok kanallı pipet kullanılabilir.

Elektronik pipeti, iki adet 8 µL dağıtma adımı ve ardından bir tahliye adımı ile 16 µL master mix aspire edecek şekilde ayarlayın. Pipeti ayarladıktan sonra 16 µL master mix aspire edin ve 384'lü dairesel plakaya dağıtmaya başlayın. İlk 8 µL'yi, bir sonraki sütunu boş bırakacak şekilde, birinci sütundaki A'dan O'ya kadar olan satırlarda birer satır atlayarak dağıtın.

İkinci sekiz µL'yi üçüncü sütunun aynı satırlarına aktarın. Ardından bir atık kabı üzerinde temizleme yapın ve bir satır atlayıp bir sütun atlama düzenini takip ederek uçları atın. Master mix 2'yi pipetlemek için plak boyunca beş döngü daha tekrarlayın.

Master mix bir ile aynı satırları kullanın ancak ikinci sütunla başlayın. Bu prosedürü, sırasıyla birinci ve ikinci sütunlarla başlayarak master mix üç ve dört için tekrarlayın, ancak bu kez primer plakasının B'den P'ye kadar olan sıralarını kullanın. Elektronik pipeti iki microliters çekmek ve ardından bir tahliye adımıyla iki microliters dağıtmak üzere ayarlayın.

96 kuyucuklu primer plakasının birinci sütun A'dan H satırına kadar olan iki mikrolitrelik primerlerini, 384 kuyucuklu plakanın birinci sütunundaki her iki satırda bir olacak şekilde, bir atık konteyneri üzerinde boşaltarak aktarın ve uçları atın. Bu deseni, birinci ve ikinci sütunlardaki kalan üç ana karışım için quatt primeriyle tekrarlayın. Ardından, 96 kuyucuklu primer plakasının ikinci sütundan 12. sütununa kadar olan kısımları için, her bir primer sütunu için 384 kuyucuklu plakada her iki sütunda bir ilerleyerek bu işleme devam edin.

Ardından, plakaları bir light cycler tavanı ve folyo ile mühürleyin ve santrifüjleyin. Santrifüj işlemini takiben kısa bir süre sonra, plakaları bir light cycler four 80 cihazına yerleştirin ve cyber green one HRM tespit formatını kullanarak döngüleri başlatın.

Önceki ile aynı döngü koşullarını kullanarak, taze hazırlanmış master mix'ler ile iki numaralı Eloqua primer plağını yeni bir 384 kuyucuklu plağa aktararak bu prosedürü tekrarlayın. Prekürsör mikro RNA imzaları, yeni bir QPCR tabanlı dizi kullanılarak yapılan profilleme ile ortaya çıkar. U6'ya göre normalize edilmiş ortalama delta CT hesaplanmış ve standardize edilmiş değerler diziye yüklenmiştir.

Isı haritaları şeklinde gösterilen üç belirgin küme oluşturan Minor yazılımı. Her bir öncül micro RNA'nın bağıl ekspresyonu gösterilmektedir; kırmızı ve mavi renkler sırasıyla bağıl ekspresyondaki artışı ve azalmayı temsil eder. Renk yoğunluğu, ekspresyon değişiminin derecesini belirtir.

Öncü microRNA'ların çoğunluğu, beklendiği üzere küçük ve önemsiz değişiklikler göstermiştir. Ancak, öncü microRNA'ların küçük bir kısmı zaman seyri deneyi boyunca önemli ölçüde artış göstermiştir. Ayrıca, bazı öncü microRNA'ların bağıl seviyeleri belirgin şekilde azalmıştır.

Bazı durumlarda, ısı haritası analizinde de birlikte kümelenirler. Deneye bağlı olarak; viral enfeksiyona, hücre tipine özgü öncül mikroRNA ekspresyonuna veya ortak bir molekül veya sinyal yoluyla düzenlenen öncül mikroRNA'lara bağlı kümeler ortaya çıkabilir.

Dörtlü kopya olarak çalıştırılan bir Kaposi sarkomu ilişkili herpes virüsü negatif örneğinden elde edilen ortalama döngü eşikleri veya ct değerleri gösterilmiştir. Önemli bir nokta olarak, yüksek hassasiyetli qPCR dizisinde bu örnekte Kaposi sarkomu ilişkili herpes virüsü latans ilişkili nükleer antijen veya KSHV Lana saptanmamıştır. Bununla birlikte, hem dahili kontrol U6 hem de yüksek düzeyde eksprese edilen bir insan öncül mikro RNA olan let-7a, saptanabilir düzeylerde eksprese edilmiştir.

Son olarak, beklendiği üzere, PCR sınıfı su ile yapılan negatif kontrol A-Q-P-C-R ürünü vermemiştir. Aynı örnekleme ikizinin kullanıldığı, iki farklı primer için erime eğrisi analizi gösterilmektedir.

İki primer çifti için erime sıcaklığının farklı olduğu açıktır, ancak örnek her tekrarda tam olarak aynı sıcaklıkta erimektedir. Kötü veya potansiyel olarak kontamine olmuş bir örneğin belirtileri, iki farklı girdi kaynağının varlığına işaret eden birkaç erime piki olabilir. Size bir robot kullanarak gerçek zamanlı QPCR deneylerinin nasıl kurulacağını göstermiş olduk.

Tüm kontrolleri ve mümkün olduğunca çok housekeeping geni eklemeniz önemlidir. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dilerim.