Özel MicroRNA Mikroarray deneyler gerçekleştirme

Bu prosedürün genel amacı, bir mikro RNA mikroarray deneyi gerçekleştirmektir. Bu işlem; öncelikle mikro RNA prob kütüphanesi içeren basılı mikroarray lamlarının temin edilmesi ve uygun kalite ile miktarda RNA örneklerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, RNA ve kontrol DNA örneği floresan boyalarla işaretlenir.

Ardından, işaretlenmiş nükleik asitler hibridizasyon için bir mikroarray lamına eklenir. Son olarak, mikroarray lamı yıkanır, taranır ve lam yeniden üretilir. Nihayetinde, münferit mikro RNA problarının hibridizasyon yoğunlukları için lamın analizi yoluyla microRNA'ların genom genelindeki ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, normal fizyolojik koşulların veya patolojik durumların, küresel ölçekte mikro ifade gereksinimlerini nasıl farklı şekilde etkilediği gibi gen ekspresyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Mikroarray üretiminin kalitesi, bir mikroarray deneyinin başarısı için en kritik faktörlerden biridir. Küçük RNA'ları koruyan bir yöntem kullanarak RNA'yı izole ettikten ve 2 mg/mL veya daha yüksek bir konsantrasyonda yeniden süspanse ettikten sonra; yaklaşık 25 µg toplam RNA'yı, T4 RNA Ligaz 1D TT ve ATP ile desteklenmiş 1X HEPs tamponu içinde 0,5 µg 5' P-C-U-D-Y 5 4 7 3' ile karıştırarak 20 µL reaksiyon hacminde RNA'yı işaretleyin. Eğer daha az RNA mevcutsa, RNA miktarını ve reaksiyonu orantılı olarak azaltın.

RNA çok seyreltikse, çöktürmeye yardımcı olması için maya tRNA'sı gibi bir taşıyıcı ekleyin ve reaksiyonu bir buzdolabının içinde buz üzerinde iki ila 24 saat boyunca inkübe edin. Ardından, sodyum asetat ekleyerek 0,3 molar düzeye getirin, ardından üç hacim etanol ekleyin ve RNA'yı -20 °C'de gece boyunca çöktürün. Slaytları ilk kez kullanmak için, 37 °C'de 30 ila 60 dakika boyunca 3 XSSC, %0,1 SDS ve %0,2 BSA içeren filtrelenmiş bir çözeltide ön hibritleme yapın.

Ardından, lamları birkaç kez suya daldırın. Daha sonra izopropanol içerisinde, lam adaptörü bulunan bir santrifüj kullanarak 22 °C'de 5 dakika boyunca 100 ×g hızında lamları kurutun. Kaldırıcı şeritleri suda durulayın.

Ardından, havada kurutmadan önce etanol içinde, bir lamı bir mikro-dizi hibridizasyon odası tabanına ve lamın üzerine, yükseltici şerit prob alanını ve beyaz şeritlerini kapatacak şekilde bir yükseltici şerit yerleştirin. Lamla karanlıkta temas kurun, çöktürülmüş işaretli RNA'yı santrifüjleyerek çöktürün, bir kez %70 etanol ile yıkayın ve peleti havada kurutun. Pelet kırmızımsı renkte olmalıdır.

RNA örneği başına, saflaştırılmış işaretli referans DNA'nın hacimce 15'te birinden 100'de birine kadar olan miktarıyla bir hibridizasyon çözeltisi hazırlayın. Hibridizasyon çözeltisinin kurumasını önlemek için, RNA peletini yaklaşık 60 µL hibridizasyon çözeltisi ile tamamen çözün. İnkübasyon sırasında, mikroarray hibridizasyon odası tabanındaki nemlendirme kuyucuklarının her birine 20 µL su ekleyin.

İşaretli RNA ve referans DNA karışımını lamın üzerine ekleyin. İnce bir pipet ucu kullanarak, kaldırıcı lamın kenarına hafifçe dokunun ve vakum yoluyla çözeltinin kaldırıcı lam ile lam arasındaki boşluğa girmesini sağlayın.

Hibridizasyon odası kapağını tabanın üzerine yerleştirin. Ardından odayı metal klipslerle mühürleyin. Tüm odayı, oda kasetiyle birlikte gelen plastik torbanın içine koyun.

Son olarak, oda kasetini ıslak bir kağıt havlu bulunan bir kabın içine yerleştirin. Ardından kabın üzerini streç filmle kapatın ve yaklaşık 24 saat boyunca 37 °C'lik nemli bir hücre kültürü inkübatöründe bekletin. Hibritleşme sonrası slaytları işlemek için, oda kasetlerini tek tek sökün; bir slaytı ve beraberindeki kaldırıcı lamı 22 °C'de iki XSSC içine daldırın.

Kaldırıcı şerit slayttan kendiliğinden düşecektir; slaytları iki kez 0,8 XSSC ile, ardından toplam bir ila iki dakika boyunca üç kez 0,4 XSSC ile yıkayın. Slaytları, slayt adaptörlü bir santrifüj kullanarak kurutun. Ardından, slaytları bir mikroarray tarayıcı ile tarayın ve görüntü dosyalarındaki yoğunlukları nicelleştirmek için blue fuse gibi bir program kullanın.

Hibridizasyon sonrası genellikle gözenekli slayt basımından veya slayt taşıma işlemlerinden kaynaklanan anormal spotları dışlamak için bireysel spotları inceleyin. Veri analizi ve sunumu için, mikro diziyi yeniden kullanmak üzere gene springing ve excel gibi programlar kullanın. Slaydı suyla durulayarak temizleyin, ardından 62 °C'ye önceden ısıtılmış 1 mM NaOH ve 0.1 X SSC içeren bir boyama kabına 10 ila 20 dakika boyunca daldırarak sıyırın.

İnkübasyonu ikinci kez tekrarlayın. Lamları, 22 °C'de hafifçe çalkalayarak 60 dakikaya kadar suyla birkaç kez yıkayın. Lamları bir santrifüj kullanarak kurutun ve 22 °C'de saklayın.

Slaytlar ön hibridizasyon yapılmadan kullanılabilir. Bu şekil, oldukça hassas ve güçlü hibridizasyon sinyallerini gösteren bir mikro-dizinin taranmış görüntüsünü sunmaktadır. Kırmızı noktalar referans DNA hibridizasyonundan, yeşil noktalar DY 5 47 ile işaretlenmiş RNA örneğinden ve sarı noktalar ise hem DNA hem de RNA'nın aynı problara hibridizasyonundan kaynaklanmıştır.

Mikrodizi hibridizasyonunun teknik tekrarları arasındaki Pearson korelasyon katsayıları yaklaşık 0,99'dur ve bu da mükemmel bir tekrarlanabilirliğe işaret eder. Bu videoyu izledikten sonra, sadece mikronazı miktarını belirlemek için değil, aynı zamanda mRNA'lar gibi diğer nükleik asit türlerini belirlemek için de özel bir mikrodizi deneyinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.