UV ile indüklenen Çoğaltma Ara Görselleştirme E. coli İki boyutlu agaroz-jel Analizi

Bu prosedürün genel amacı, replikasyonun DNA lezyonlarıyla karşılaştığı durumlarda ortaya çıkan DNA yapısal ara ürünlerini iki boyutlu jel analizi kullanarak görselleştirmektir. Bu işlem, öncelikle replikasyon bloklayıcı lezyonların indüklendiği aktif olarak bölünen hücrelerden DNA'nın izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, geri kazanılan DNA'yı boyutuna göre ayırmak için jel elektroforezi kullanılır.

Ardından, şeritler kesilir ve DNA'yı hem boyutuna hem de şekline göre daha fazla ayıran ikinci bir jele yatay olarak yeniden dökülür. Son olarak, UV kaynaklı hasarın oluşturulmasından önceki zamanlarda ve sonraki çeşitli zamanlarda, replike olan DNA fragmanlarıyla ilişkili olan DNA yapılarını görselleştirmek için Southern analizi kullanılır. Nihayetinde, bu prosedür, belirli mutantlarda DNA lezyonlarını işleyememenin DNA onarım ara ürünlerinin birikimiyle sonuçlandığını göstermek için kullanılabilir.

Merhaba, benim adım Arthur Ian. Portland Eyalet Üniversitesi'ndeki Corella Laboratuvarı'ndayım. Merhaba, benim adım Brand she, ben de Corella Laboratuvarı'ndayım.

Bugün sizlere iki boyutlu jel elektroforez prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü DNA replikasyon ve onarım ara ürünlerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Bu prosedüre başlamak için, ampicillin içeren DGC thigh ortamında 37 °C'de PBR 3 22 plazmidini taşıyan e coli'den 200 µL'lik gece boyu kültür geliştirin. DGC thigh ortamının kullanımı UV korumasını minimize eder. Gece boyu inkübasyonun ardından hücreleri 14.000 RPM'de 30 saniye boyunca pelletleyin.

Ardından, hücre peletini ampisilin içermeyen 200 µL DG C th ortamında yeniden süspanse edin ve inoküle edin. 20 mL DG C thigh ortamında, ampisilin seçimi olmadan, 37 °C'deki çalkalamalı inkübatörde OD 600 değeri 0,5'e (bu değer yaklaşık 5 × 10⁸ hücre/mL'ye karşılık gelir) ulaşana kadar kültürleri büyütün. Ampisilin olmadan büyütme işlemi, bazı mutantlarda ortaya çıkabilecek anormal veya üretken olmayan replikasyon ara ürünlerine karşı seçilimi önler.

Ek olarak, hasarı indüklemek için UV ışığı kullanılıyorsa, ampisilinin ortamdan uzaklaştırılması gereklidir; çünkü ampisilin bu dalga boylarında güçlü bir absorbsiyon göstererek koruyucu etki yapar ve hücreler büyürken etkili UV dozunu azaltır. Metrekare başına saniyede yaklaşık bir J/m²/s'lik bir maruziyet hızı üreten 15 watt'lık bir germisidal lambaya olan mesafeyi belirlemek için bir UVC fotometresi kullanın.

UV ışınlamasından sonra fotoliyaz tarafından siklobütan pirimidin dimerlerinin foto-reaktivasyon tersinmesini önlemek için sonraki adımlar sarı ışık altında gerçekleştirilmelidir. İstenen hücre yoğunluğuna ulaşıldığında, tüm hücre popülasyonunun eşit şekilde ışınlanmasını sağlamak için kültürü bir pipet yardımıyla döner bir platform üzerindeki 15 santimetre çapındaki Petri kabına aktarın. Ardından, kültürleri 50 joules per meter squared ile ışınlayın ve hemen steril, önceden ısıtılmış bir flaska aktararak 37 degrees Celsius'lik çalkalamalı inkübatöre geri yerleştirin.

Deney süresi boyunca bu doz, incelenecek her bir zaman noktası için tek zincirli DNA'nın her 4.5 kilobazında ortalama bir siklobütan pirimidin dimeri oluşturur. Kültürden 0.75 mililitrelik bir alikotu, 0.75 mililitre buz soğukluğundaki net 30 tamponuna pipetleyin. Net 30 tamponu, replikasyonun ve nükleotid eksizyon onarımının ilerlemesini engelleyen bir durdurma tamponu görevi görür.

Durdurma tamponu eklendikten sonra, örnekler zaman serisi tamamlanana kadar buz üzerinde bekletilebilir. Zaman serisinin ardından her bir örneği pelletleyin ve pelletleri yeniden süspande edin. Hücreleri 150 µL lizis tamponu içerisinde, karıştırmadan 37 °C'de 20 dakika boyunca lize edin.

Tek zincirli bölgeler veya dallanma noktaları içeren yapıların replikasyonu kesme kuvvetlerine karşı daha hassas olduğundan, ağız kısmını genişletmek ve kesme kuvvetlerini en aza indirmek için pipet uçlarını bir jiletle kesin. Genel olarak, DNA restriksiyon enzimleri ile sindirilene kadar pipetleme ve ajitasyon minimum düzeyde tutulmalıdır; lizisten sonra proteinaz K ve sarkosyl ekleyin ve inkübasyonun bir saat daha devam etmesini sağlayın. Bu işlem, proteinle ilişkili DNA fragmanlarının serbest kalmasını sağlar.

Aktif olarak replike olan DNA genellikle protein veya membran komplekslerine bağlı olduğundan, bu işlem replikasyon fragmanlarının veriminin artmasına yardımcı olur. Bir saat sonra, her örneğe iki hacim fenol ekleyip tüpleri beş dakika boyunca hafifçe ters yüz ederek örnekleri ekstrakte edin. Ardından iki hacim kloroform, izoamil alkol ekleyin ve tüpleri beş dakika daha hafifçe ters yüz edin.

Ardından, örnekleri bir mikrosantrifüjde 14, 000 RPM hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin ve her örneğin üstteki sulu fazını yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra dört hacim kloroform ISO alkol ekleyin ve tüpleri tekrar beş dakika boyunca nazikçe altüst ederek karıştırın. Örnekleri yeniden 14, 000 RPM hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Bir behere 250 milliliters 0.1 xte koyun, üzerine bir diyaliz membranı yerleştirin ve membranın üzerine her bir örnekten 100 microliters damlatın. Örneklerin bir saat boyunca diyaliz olmasını bekleyin. Her bir örnekten 80 microliters alarak, içerisinde 20 microliters enzim karışımı bulunan yeni bir 1.5 milliliter tüpe aktarın.

Numuneleri 37 °C'de gece boyunca sindirin. PV two, plazmidi replikasyon orijininin hemen aşağısından lineerize eder. Agaroz jeli yüklemeden önce, 100 µL kloroform ve bromo içeren 6x yükleme boyasının 20 µL'sini ekleyin.

Her örneğe fenol mavisi ve ksilen siyanı ekleyin ve karıştırın; kloroform, DNA uçlarına bağlı kalan tüm PV two'ları uzaklaştıracaktır. Kısıtlanmış DNA örneklerini birinci boyuttan geçirerek iki boyutlu agaroz jel analizine başlayın. İlk olarak, önceden hazırlanmış 1X TBE içerisindeki %0,4'lük agaroz jelin ilk kuyucuğuna Lambda hind three boyut markörü yükleyin.

Ardından, jel dilimlemeyi kolaylaştırmak için şeritler atlayarak, her bir örnek için yükleme boyası içeren sulu fazdan 40 µL yükleyin. Elektroforezi takiben, birinci boyutu santimetre başına bir volt gerilimle yaklaşık 12 ila 15 saat boyunca çalıştırın. Düşük voltaj ve düşük yüzdeli AGROS jeli, DNA fragmanlarını öncelikle boyutlarına göre ayırmaya hizmet eder.

Birinci boyut çalışması tamamlandıktan sonra, Lambda Hind III markörünü içeren birinci şeridi kesip çıkarmak için büyük bir kasap bıçağı kullanın ve etidyum bromür ile boyayın. İkinci boyut için, Lambda Hind III markörünü kılavuz olarak kullanarak jel şeritlerini büyük kasap bıçağı ile dilimleyin; her şeritte lineerize plazmidin ilerlemesinin beklendiği bölgenin altındaki kısmı kesin ve atın. İkinci boyutu dökmek için, her bir dilimi boş bir jel döküm kalıbının üst kısmına yatay olarak yerleştirin.

Bir XTBE içerisinde %1 AROS çözeltisi hazırlayın ve 55 °C'ye kadar soğutun. Soğuduktan sonra, jel dilimlerini tamamen kapladığından emin olarak, ikinci boyutu dökmek için jel çözeltisini dökün. Jeli dökmeden önce dilimlerin eşit şekilde yönlendirildiğinden ve döküm düzeneğinin teraziyle dengelendiğinden emin olmak önemlidir.

Jel donduktan sonra, tamponun yeniden dolaşımına izin veren bir elektroforez ünitesinde, santimetre başına 6,5 volt ile beş buçuk ila yedi saat boyunca ikinci boyutu çalıştırın; yüksek voltaj ve yüksek yüzdeli Agros jeli, DNA fragmanlarını boyutlarının yanı sıra şekillerine göre de etkili bir şekilde ayırır. Doğrusal olmayan şekiller, elektroforezi takiben ikinci boyutta daha yavaş ilerler. Jeli bir kez suyla durulayın ve ardından 400 mililitre 0,25 molar hidroklorik asit içerisinde, hafif ajitasyonla 15 dakika boyunca iki kez yıkayın.

Asit yıkamaları, DNA moleküllerini Southern analizinde daha verimli transfer edilen daha küçük fragmanlara kısmen bölmeye yarar; bu işlem, DNA replikasyon ara ürünlerinin büyük boyutu ve olağan dışı şekli nedeniyle gereklidir. Jeli alkali transfere hazırlamak için, jeli tekrar su ile durulayın, ardından 30 dakika boyunca 400 mililitre 0,4 molar sodyum hidroksitte iki kez yıkayın. Jellerdeki DNA, bu prosedürün yazılı kısmında açıklandığı üzere, 0,4 molar sodyum hidroksit içeren aşağı yönlü bir alkali transfer sistemi kullanılarak yüksek bağlayıcı n artı naylon membrana transfer edilir; DNA transferinin 6 ila 12 saat sürmesine izin verin ve DNA transferinin ardından yazılı protokolde belirtildiği şekilde prob hibridizasyonu ile devam edin.

Membran problandıktan ve yıkandıktan sonra, sıvı görünür şekilde kaybolana kadar membranı bir kağıt havlu üzerine yerleştirin. Ardından membranı polivinil klorür plastik film ile sarın ve bir fosfor imajlama ekranına maruz bırakın. Son olarak, radyoaktivite bir storm eight 40 ve onunla ilişkili image quant kullanılarak görselleştirilebilir ve nicelendirilebilir.

2D agaroz jel analizi ile gözlemlenen, iki adet kısıtlanmış PBR 3 22 plazmidinin göç paterni şematize edilmiştir. Replike olmayan lineer plazmidler, 4.4 KB'lık lineer fragmanlar olarak ilerler; replike olan plazmid formları ise daha büyük boyutları ve lineer olmayan şekilleri nedeniyle replike olmayan fragmanlardan daha yavaş göç eden Y şeklinde yapılar oluşturur. Bu göç paterni, UV ışınlamasının ardından lineer bölgeden kuyuya doğru uzanan bir ark oluşturur.

Koni bölgesinde çift Y veya X şeklinde moleküller gözlemlenir ve bunlar Y şeklindeki molekül arkından daha yavaş göç ederler. P 32 etiketli PBR 3 22 ile problanan 2D jelin güney analizine bir örnek, UV ışınlamasından hemen sonraki hücreler ve UV ışınlamasından 15 dakika sonraki hücreler için gösterilmiştir. Radyasyon sonrası hücreler eksponansiyel fazda hızla büyüdüğünde, toplam plazma DNA'sının yaklaşık %1'i Y arkında bulunabilir.

Hasarlı bölgelerde bloke olmuş replikasyon çatallarının birikmesiyle birlikte, Y şeklinde moleküllerde geçici bir artış gözlemlenir. L şeklindeki replikasyon ara ürünleri de geçici olarak birikir ve lezyonların onarıldığı zamanla ilişkili bir süreye kadar kalmaya devam eder. Size, iki boyutlu jel elektroforezi kullanarak DNA onarım ara ürünlerinin nasıl görselleştirileceğini göstermiş olduk.

Bu prosedürü uygularken, verimi düşürebilecek makaslama kuvvetlerinin farkında olmak ve tüm numunelere ve jellere nazik davranmak önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.