Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

Aşağıdaki deneyin genel amacı, iki ve üç boyutlu kültür ortamlarındaki hücreleri mekanik olarak uyarmak için kullanılan cihazları mikro ölçekte üretmektir. Bu, dikey olarak hareket ettirilen mikro sütun dizisi üretmek için çok katmanlı sandviç kalıplama ve istifleme tekniği kullanılarak gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, dikey olarak hareket ettirilen mikro sütun dizisi, bir kültür filmini germek için modifiye edilir; bu işlem, film üzerinde kültüre edilen hücrelere iyi kontrol edilmiş gerilmeler uygular.

Alternatif olarak, hücrelere mekanik stimülasyon uygulamak amacıyla mikro desenli biyomalzeme yapıları sıkıştırmak için dizi modifiye edilebilir. Üç boyutlu hidrojel dizilerinde kültüre edilen hücrelerde, floresan referans işaretçilerinin görüntü analizine dayalı olarak, dizi boyunca bir dizi iki boyutlu eko biyaksiyel ve üç boyutlu kompresyon gerinimlerinin eşzamanlı uygulandığını gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Merhaba, ben Toronto Üniversitesi Mekanik ve Endüstri Mühendisliği Bölümü ile Biyomalzemeler ve Biyomedikal Mühendisliği Enstitüsü'nden Craig Simmons ve U Sun laboratuvarlarından Chris Mariahs.

Bugün sizlere, hücreleri mekanik olarak uyarmak için kullanılan mikro cihazların imalat prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, hücrelerin in vitro kültürde çeşitli mekanik kuvvetlere nasıl tepki verdiğini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Sandviç kalıp üretim süreci, kürlenmemiş poli dimetil siloksan veya PDMS'in üzerine, bir SU-8 master üzerine yerleştirilmiş bir asetat kağıdının konulmasını içerir. Sandviç yapı, köpük cam ve metalden oluşan bir yığın içerisine yerleştirilir ve bir fırında kompresyon altında kürlenir. Son olarak, yığın sökülür ve desenli PDMS tabakası korunarak asetat kağıdı soyulur.

Bu sürece başlamak için PDMS, monomer ve çapraz bağlayıcıyı iyice karıştırın. Standart 10'a bir oranında, üç mililitre kürlenmemiş PDMS karışımını daha önceden hazırlanmış bir SU-8 mastarına dökün ve polimeri bir vakum odasında gazdan arındırın (degazasyon yapın). Ardından, köpük pedi ve SU-8 mastarını pleksiglas bir taban plakasına yerleştirin.

Hava kabarcığı kalmadığından emin olarak, bir mürekkep püskürtmeli şeffaf filmin pürüzsüz tarafını kürlenmemiş PDMS'in üzerine dikkatlice indirin. Ardından, şeffaf filmin üzerine, ikinci köpük pedin altına ve pleksiglas üst plakanın altına gelecek şekilde silanize edilmiş bir cam lam yerleştirin. Bu katmanlı yapıyı bir C-kelepçe kullanarak birbirine sabitleyin.

PDMS sandviçi, 80 °C'deki bir fırında en az dört saat boyunca kürleyin. Kürleme işleminin ardından sandviçi fırından çıkarın ve soğumaya bırakın. Soğuduktan sonra klempi çıkarın ve sandviçi sökün.

Şeffaf tabakayı, patentli PDMS filmi tutarak SU eight mastarından dikkatlice ayırın. Fazla PDMS'i temizlemek için desen filminin kenarlarını kesin; desen katmanlarını kullanıma hazır olana kadar tozsuz bir ortamda saklayın. Bu protokolün bir sonraki bölümü, dikey olarak hareket ettirilen direklerden oluşan mikro üretimli bir dizinin oluşturulmasını içermektedir.

Mikro sütun dizisini oluşturmak için çok katmanlı bir üretim süreci gereklidir. En alttaki desenli PDMS katmanı, sandviç kalıp üretimiyle hazırlanır. Bu deneyler için, çapları 600 ile 1.200 mikron arasında değişen dairesel desenler kullanılmıştır.

PDMS tabakasını temiz bir cam lam üzerine aktarmak için, PDMS ve cam yüzeyleri oksijen plazması ile işlemek amacıyla bir Corona deşarj ünitesi kullanın. Ardından iki yüzeyi birbirine temas edecek şekilde yerleştirin. Bağlanma işlemini tamamlamak için yığını 80 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı plaka üzerinde 10 dakika bekletin.

Şeffaf folyoyu soyun ve atın. Bu işlem, desenli PDMS filmin sert bir substrattan hiç ayrılmamasını sağlayarak münferit katmanların büzülmesini önler. İkinci sandviç kalıplama katmanı, istenen diyafram ve sütun yapısının negatif replika kalıbı olarak oluşturulur.

Bu gösterimde, bu tabakayı oluşturmak için 500 mikron çapında dairesel destekler kullanılmıştır. İlk olarak, negatif replika kalıbı çift taraflı bant kullanarak bir lam üzerine geçici olarak sabitleyin ve vakumlu desikatörde silolayarak kürlenmemiş PDMS'yi sandviç kalıp tabakasına dökün, gaz giderme işlemini yapın ve 1000 devir/dakika hızında 45 saniye boyunca spin kaplama yaparak 60 mikron kalınlığında bir aktüasyon diyaframı elde edin; spin kaplanan PDMS tabakasını 80 °C'de yaklaşık 20 dakika boyunca veya PDMS yapışkan hale gelip dokunulduğunda kalıcı olarak deforme olmayana kadar kısmen kürleyin. Kısmen kürlenmiş PDMS tabakasını cam lamdan ve çift taraflı banttan ayırın ve şeffaf filmi bir çift cam taşıma lamına sabitleyip plazma işlemine tabi tutun.

Kısmi kürlenmiş PDMS'yi işlemden geçirin, ardından PDMS'yi ters çevirip özel yapım bir hizalayıcıya yerleştirin. Hizalayıcı, bir mikro manipülatöre monte edilmiş vakumlu bir tabladan oluşur. Ardından ilk PDMS katmanına plazma işlemi uygulayın ve ardından bunu vakumlu tablanın altındaki döner tablaya yerleştirin.

İki katman arasındaki hizalamayı 12 kat büyütmeli bir avatar makine görme sistemi ile gözlemleyin. Manipülatörü kullanarak katmanları hizalayın ve dikkatlice birbirine temas ettirin. Katmanların birbirine yapışması için bir parmakla hafifçe bastırın.

Ardından sandviçi hizalayıcıdan çıkarın. Cam taşıma lamlarını çıkarın ve katmanların birbirleriyle tam temas halinde olduğundan emin olun. 80 °C sıcaklıktaki bir fırında 30 dakika daha kürleme yapın.

30 dakika sonra, şeffaf ve silolanmış replika PDMS kalıbı cihazdan soyulup atılabilir. Deforme olan iki boyutlu bir substrat üzerinde kültüre edilen hücrelerle deneyler yapabilmek için cihaz, ardından 80 °C'de en az dört saat boyunca tamamen kürlenir. Mikro aktüatör dizisi, cihaza üçüncü bir PDMS tabakasının bağlanmasıyla modifiye edilir.

Üçüncü PDMS katmanı, iki katmanlı bir yapıdan oluşur. Alt daire, hareketli mikro direklerin altındaki aktivasyon boşluğunun boyutuyla eşleşir. Üst dairenin çapı, yükleme direklerinin çapından 100 mikron daha büyüktür.

Bu özellikleri bir bağlantı alanına bağlayan 200 mikron genişliğinde bir mikro kanal, yükleme direklerini ve kültür filmini yağlamak için kullanılacaktır. Cihazı 2D kültür için modifiye etmek için öncelikle yazılı protokolde açıklandığı şekilde konnektörleri imal edin ve cihaza yapıştırın. Ardından, bir şeffaf asetatın pürüzsüz tarafına 10 ila 15 mikron kalınlığında bir PDMS tabakası spin kaplama yöntemiyle uygulayın ve kürleyin.

İnce PDMS film 80 °C'de en az dört saat boyunca bekletilir. Bir sonraki adım, aktüatörlere vakum uygulamak ve PDMS tabakasını cihaza yapıştırmaktır. Bunu gerçekleştirmek için.

İlk olarak, plazma ile işlem görmüş ve bağlanmış direk dizisini indirmek için aktüatörlere düşük seviyeli vakum uygulayın. Yazılı protokolde açıklandığı şekilde, spin kaplama ile uygulanmış PDMS film aktüatörlü mikro cihaza yerleştirildiğinde, direkler ve kültür filmi kısa bir süre hidrofilik kalacaktır. Ardından, yağlayıcı şırıngayı cihaza bağlayın ve yağlama kanallarını deiyonize su içerisinde %90 gliserol çözeltisi ile doldurun.

Yağlamanın yanı sıra, bu formülasyon PDMS'in hidrofilisitesini süresiz olarak koruyarak sürtünme katsayılarını düşürür. Cihazı 40 °C sıcaklıktaki bir ısıtıcı plakaya yerleştirin ve kanala yağlayıcı enjekte etmeye devam ederek küçük bir basınç artışı oluşturun. Birkaç dakika sonra, hava kabarcıkları PDMS boyunca yayılacak ve tüm yüzeyler yağlanmış olacaktır.

Son adım için, bir bisturi kullanarak direkleri serbest bırakan negatif basıncı kaldırın. İnce PDMS filmin çevresini kesin. Şeffaf destek tabakasını cihaz plazma bağından dikkatlice soyun.

Cihaz kültür alanı etrafına elle kesilmiş bir PDMS conta yerleştirin. Cihazı beş dakika boyunca %70 etanol içinde bekleterek sterilize edin, ardından biyolojik güvenlik kabininde 45 dakika boyunca germisidal UV ışığına maruz bırakın. Yüzeyi plazma ile işlemden geçirin ve 100 µg/mL kolajen ile dört °C'de gece boyunca inkübe edin.

Gece boyunca inkübasyonun ardından, cihazı steril fosfat tamponlu salin veya PBS ile yıkayın ve santimetrekare başına 10 ila 15.000 hücre olacak şekilde hücre ekimi yapın. Standart hücre kültürü protokollerini takiben, mikro aktüatör dizisi, üç boyutlu foto-desenli hidrojel konstrüktlarda kültüre edilen hücreler için deneyler yürütmek üzere modifiye edilebilir. İlk olarak, çok katmanlı PDMS tabanlı bir platform hazırlanır.

Taban platformu bir lam ve ilgili bir lamel ile kaplandıktan sonra, hidrojel öncül çözeltisi enjekte edilir. Ardından, fotopolimerize olabilir bir biyomalzeme dizin üzerine mikro desenlenir ve kalan öncül çözelti yıkanarak uzaklaştırılır. Dikey olarak harekete geçirilen yükleme direklerinden oluşan bu dizi, daha sonra üç boyutlu biyomalzemelerde kültüre edilen hücrelere basımlı mekanik kuvvetler uygulamak için kullanılabilir; direklerin etrafındaki alanlar scotch bant parçalarıyla maskelenerek cihaz, PDS 2010 lab COTER iki sisteminde paraline C ile kaplanır.

Bu işlem, biyomalzeme sistemi için polimerizasyon kinetiğini iyileştirecektir. Kaplama tamamlandıktan sonra, cihazı kaplama sisteminden çıkarın ve scotch bandını soyarak sütunların üzerinde konformal bir paraline C tabakası bırakın. Ardından, cam lameli %95 etanoldeki %2 hacim/hacim trimetoksi profil metakrilat çözeltisine iki dakika boyunca daldırarak metakrilleştirin.

Lamı durulayın. %100 etanol içine daldırın, ardından yüzeyde metakrilat grupları kalacak şekilde 100 °C'de fırınlayın. 200 mikron kalınlığında bir PDMS ara katman dökün.

Bir Petri kabına film yerleştirin ve küçük bölümler halinde kesin. Bu küçük bölümlerden dördünü, meac ile ilişkili lamın kenarlarına plazma ile yapıştırın. Ardından, bu boşlukları Lene C kaplı cihazın PDMS alanlarına plazma ile yapıştırın.

Son olarak cihazı %70 etanol ile yıkayarak sterilize edin ve biyolojik güvenlik kabininde 45 dakika boyunca germisid veya UV ışığına maruz bırakın. Hücre yüklü PEG hidrojellerini cihazlar içinde fotolitografik olarak desenlemek için; öncül ve foto başlatıcı çözeltilerini yazılı protokolde açıklandığı şekilde hazırlayın ve ağırlık/hacim cinsinden %0,4 konsantrasyona sahip bir foto başlatıcı çözeltisi elde etmek için iyice karıştırın.

Karışımı sterilize etmek ve partikülleri uzaklaştırmak için 0,45 mikronluk bir şırınga filtresinden süzün, tripsinize edilmiş hücre kültürlerini steril kültür ortamında hedef uç nokta hücre konsantrasyonunun iki katı olacak şekilde bir hücre süspansiyonu olarak hazırlayın. Ardından hücre süspansiyonu ile süzülmüş hidrojel öncül foto-başlatıcı çözeltisini birer bir oranında karıştırın. Çözeltiyi, uzun bir 25 gauge iğne kullanarak mikro cihaza enjekte edin.

Cihazda hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Basılı bir şeffaf maskeyi, cihaz yüzeyindeki hizalama işaretlerine göre hizalayın. Cihaz yüzeyinde 365 nanometre dalga boyunda ve 17,5 milliwatt/cm²'lik bir UV dozu sağlayacak bir UV aydınlatma sistemi kurun.

Aydınlatma işleminin ardından, maske üzerinden hidrojeli 195 saniye boyunca ışığa tutun. Polimerize olmamış hidrojel öncül çözeltisini PBS ile yıkayarak uzaklaştırın ve PBS'yi, hidrojel yapıları sıkıştırmak için yükleme desteklerini harekete geçirecek kültür ortamı ile değiştirin. Burada, 2D mekanostimülatif kültür için tamamlanmış bir örnek cihaz gösterilmektedir.

Aktüatör basınç iletim kanallarını işaretlemek için kırmızı boya, yağlama kanallarının gerilme karakterizasyonunu işaretlemek için ise mavi boya kullanılmıştır. Substratlar üzerindeki floresan boncuk hareketlerinin takibi ile uygulanan gerilme alanları belirlenmek için deneyler yapılabilir. Kırmızı noktalar boncukların deforme olmamış konumlarını, yeşil noktalar ise deforme olmuş konumlarını temsil etmektedir.

Yeşil boyanın aktüasyon basınç kanallarını işaretlemek için kullanıldığı, üç boyutlu sıkıştırma deneyleri için bir örnek cihaz burada görülebilir. Mikro post dizisinin üstten görünümü, postların üzerinde desenlenmiş hidrojel yapıyı ve hidrojel yapı içindeki floresan boncukların post yan görünümle yeniden yapılandırılmış görüntülerini ortaya koymaktadır. Dinlenme durumu ve 55 kilo pascal aktüasyon basınçları altındaki görüntüler, üç boyutlu bir kültür sistemindeki gerinim karakterizasyon sürecini göstermektedir.

Böylece, iki veya üç boyutlu kültür sistemlerindeki hücreleri mekanik olarak uyarmak için kullanılan cihazların nasıl üretileceğini göstermiş olduk. Bu işlemi gerçekleştirirken, cihazlarınızı mümkün olduğunca temiz ve tozsuz tutmaya dikkat etmeniz ve özellikle hizalama adımlarında sabırlı olmanız önemlidir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.