Büyük Ölçekli Zebra balığı Tabanlı In vivo Küçük Molekül Ekran

Aşağıdaki deneyin genel amacı, embriyonik gelişim ve fizyolojinin temel yönlerini spesifik olarak modüle eden küçük molekülleri keşfetmektir. Bu, ilk adımda çok sayıda döllenmiş yumurtanın 96 kuyucuklu plakalara yerleştirilmesi ve ikinci adımda tarama yapılmasıyla gerçekleştirilir. Küçük molekül kütüphanesinden alınan alikotlar, 96 kuyucuklu plakalardaki embriyolara eklenir.

Küçük moleküller tarafından ortaya çıkarılan fenotipler için kuyucuk plakaları incelenir. Hangi küçük moleküllerin süper balık gelişimini veya fizyolojisini spesifik olarak etkilediğini gösteren sonuçlar elde edilir. Merhaba, ben Vanderbilt Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden Charles Hong.

Laboratuvarımızda, danio rerio embriyolarını kullanarak yüksek kapasiteli kimyasal taramalar yapıyoruz. Bu, yeni biyoaktif bileşiklerin keşfi için yaygın olarak uyarlanabilen nispeten kolay bir tekniktir. Kimyasal tarama gününden önceki gün öğleden sonra, 10 ila 20 adet zebra balığı üretim tankı hazırlayın.

Her tankın içine bir bölücü yerleştirin ve her tankı, bir yetişkin erkek ile bir veya iki yetişkin dişiyi iç kaba aktarmak için bir balık kepçesi kullanarak akuakültür sisteminden gelen suyla doldurun. Her üretim tankında, tankları etiketleyin ve tarama sabahında üzerlerini bir kapakla kapatın. Bölücüleri üretim tanklarından çıkarın ve zebra balıklarının çiftleşmesine izin verin.

Sonraki bir saat boyunca, döllenmiş yumurtaların her bir iç kabın altındaki ızgaradan aşağı düşmesine izin verin. Bir saat sonra, yetişkin zebra balıklarını kalıcı depolama tanklarına geri aktarın.

İç kabı çıkarın ve her bir üretim tankındaki suyu plastik bir çay süzgeciyle süzerek yumurtaları toplayın. Süzgeci bir Petri kabının üzerine ters çevirin ve yumurtaların Petri kabına dökülmesi için süzgeci nazikçe durulayın. E three ortamı içeren bir yıkama şişesi kullanarak, opak görünen tüm döllenmemiş yumurtalar uzaklaştırılmalıdır.

Tek kullanımlık plastik bir pipet kullanarak, her çiftleşme çaprazlamasından yaklaşık 200 embriyo elde edilmelidir. Ardından, cam bir pastör pipeti kullanarak E3 ortamındaki yaklaşık beş embriyoyu 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın. Embriyolar 96 kuyucuklu plakaya dizildikten sonra.

12 kanallı bir pipet kullanarak kuyucuklardaki E three ortamını mümkün olduğunca uzaklaştırın. Embriyoları delmemeye dikkat edin. 12 kanallı pipeti kullanarak 250 microliters E three ekleyin.

Embriyoların kurumasına izin vermemek için her kuyucuğa mümkün olan en kısa sürede 0.5 µg/mL kanmısın içeren besiyeri ekleyin. Bileşiklerin ekleneceği istenen aşamaya ulaşana kadar 96 kuyucuklu plakaları 28.5 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Bu protokolde, erken embriyonik örüntülenmeyi bozan bileşikler aranmaktadır ve embriyolar üç saat boyunca veya embriyoların %90'ından fazlası 1000 hücreli aşamaya gelene kadar inkübe edilecektir; küçük molekül kütüphaneleri genellikle bu şekilde tedarik edilir.

Her bir bileşiğin DMSO içinde 10 millimolar stok olarak saklandığı 96 kuyucuklu bir kaynak plakada, embriyolar istenen evreye ulaşmadan yaklaşık 60 dakika önce, küçük molekül alikotları içeren uygun sayıda 96 kuyucuklu plakayı çözdürün. Plakalarda yoğuşmayı en aza indirmek için kaynak plakaların seri veya diğer tanımlama numaralarını not edin. Kurutucu içeren bir kurutma haznesine yerleştirin. Sağ.

Plakaları, çok kuyucuklu plaka adaptörü bulunan bir masaüstü santrifüjde kısa süreliğine döndürün. Kaynak plaktaki alüminyum kapama bandını çıkarın ve 12 kanallı bir pipet kullanarak kaynak plaktaki bileşikleri DMSO ile istenen konsantrasyona seyreltin. Bu protokolde, 0,5 millimolar nihai konsantrasyon kullanıyoruz ve 10 millimolar stok plakayı seyreltmek için 4,75 microliters DMSO ekliyoruz.

96 kuyucuklu plakadaki embriyolar istenen evreye ulaştığında, kaynak plakalardan embriyoların bulunduğu alıcı plakalara 2,5 µL bileşik aktarmak için 12 kanallı bir pipet kullanın. Artık embriyoları ve bileşikleri içeren plakaların üzerini kapaklarla kapatın ve kaynak plakaların tanımlama numarasını embriyo plakalarının üzerine kaydedin. Plakaları nazikçe dairesel hareketlerle sallayarak karıştırın ve 28,5 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.

Kullanılmamış küçük moleküller içeren her kaynak plakayı alüminyum folyo ile kapatın, bantlayın ve uzun süreli saklama için -80 °C dondurucuya yerleştirin. Görsel taramayı gerçekleştirmeden önce, spesifik bir hit kriteri belirleyin. Örneğin, beyin gelişiminin dörtlü küçük molekül inhibitörleri taramasında, bir hit, ön beynin kaybına neden olan bir bileşik olabilir.

Gözlerin yokluğu, ön beynin kaybının kolay bir görsel göstergesidir ve gelişimdeki istenen zamanlarda analiz yapmak için floresan kullanımı gerektirmez. Bileşikle işlem görmüş embriyoları içeren 96 kuyucuklu plakaları inkübatörden çıkarın ve dört beyin gelişiminin küçük molekül inhibitörlerini tararken her bir kuyucuğu stereo mikroskop altında inceleyin; dört beyin gelişimsel inhibisyonunun bir belirteci olarak göz kaybını değerlendirmek için plakaları 28. saatte inceleyin. Beş embriyodan en az üçünün belirtilen fenotipi sergilediği her kuyucuk için plaka kimliğini ve kuyucuk konumunu kaydedin. 96 kuyucuklu plakayı tekrar inkübatöre yerleştirin.

48. saatte göz ve ön beyin kaybını yeniden teyit edin. Embriyoların ön beyni olmayacak olsa da, en az dört güne kadar hayatta kalacaklardır. Bileşiğin etkilerini birkaç farklı dozda tekrar test ederek potansiyel bir etkiyi yeniden teyit edin; her doz için 10 embriyo, 48 kuyucuklu plaka formatında 0,5 mililitre E3 medyumunda test edilir.

Yeniden test etmek için bileşiğin hazırlandığı zamanlama, orijinal taramanınkiyle aynı olmalıdır. Bileşiğin yeniden test edilmesi sonucunda uyarılan fenotip doz bağımlı bir şekilde yeniden üretildiğinde, bir HIIT onaylanmış olur. Son olarak, kimyasal kütüphanedeki küçük molekül veri tabanından hi bileşiğini tanımlayın.

Zebrafish tabanlı görsel kimyasal tarama yöntemini kullanarak, vücut ekseni üzerindeki etkisine dayanarak küçük moleküllü bir hedgehog sinyal inhibitörü keşfettik. Bu görüntü, hedgehog inhibitörüne maruz kalan ve kuyrukta belirgin ventral kıvrılma sergileyen embriyoları göstermektedir. 24. saatte incelenen aynı embriyolar, 48. saatte hala ventral kıvrılma fenotipini sergilemektedir.

Bu görüntü, bileşik ile işlem görmüş embriyoyu hedgehog yolu mutant embriyosu ile karşılaştırmalı olarak göstermektedir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, tek bir kişi haftada sadece birkaç saat içinde yaklaşık 400 bileşiği tarayabilir. Bu teknik ayrıca kimyasal biyologların hücre gelişimi, hücre sinyal yolları ve embriyonik gelişim gibi konuları incelemesinin önünü açmıştır.

Karakterize edilmemiş küçük moleküllerle çalışırken, bu moleküller potansiyel olarak tehlikeli olabileceği için laboratuvar önlüğü ve eldiven kullanarak uygun güvenlik önlemlerini almak önemlidir.