Zebrafish kimyasal ekranlar için otomatik görüntüleme ve analiz geliştirilmesi.

Bu videoda, zebrafish embriyolarında fibroblast büyüme faktörü Ras-MAPK kinaz yolunun küçük molekül tabanlı modülasyonunu değerlendirmek için görüntü tabanlı yüksek içerikli tarama gerçekleştirilmektedir. Transgenik erkek ve yabani tip dişi zebrafishler bir üretim kafesinde çiftleştirilir. Döllenmiş yumurtalar dibe çöker, buradan toplanarak bir Petri kabına aktarılır. Embriyolar gece boyunca inkübe edilir ve ardından yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu bir plakadaki münferit kuyucuklara yerleştirilir.

FGF sinyalini hiperaktive etmek için küçük molekül BCI eklenir ve plaka altı saat boyunca inkübe edilir. Her bir kuyucuktan konfokal plaka okuyucu ile görüntüler alınır ve belirli embriyonik yapılardaki floresan yoğunluklarını raporlayan, özel olarak tasarlanmış bir algoritma kullanılarak analiz edilir. Merhaba, ben Pittsburgh Üniversitesi Mikrobiyoloji ve Moleküler Genetik Bölümü'nden Dr. Michael Chang laboratuvarından Hiba Kado.

Merhaba, ben Pittsburgh Üniversitesi İlaç Keşfi Enstitüsü'nden Andrea Spock. Bugün size, kimyasal işlem için zebra balığı embriyolarının üretilmesi, seçilmesi ve dizilmesi prosedürünü göstereceğiz. 96 kuyucuklu bir plakada, fibroblast büyüme faktörü aktivitelerini raporlayan transgenik embriyolar kullanacağız ve bu yolu hiperaktive eden bir molekül ile işlem yapacağız.

Transgenik zebra balığı embriyolarında fibroblast büyüme faktörü aktivitesini otomatik olarak elde etme, analiz etme ve nicelendirmek için yüksek içerikli tarama metodolojisini nasıl kullandığımızı göstereceğiz. Bu prosedür, transgenik zebra balıklarını ve yüksek verimli kimyasal taramaları kullanmaya yönelik platform teknolojisini vurgulayacaktır. Öyleyse başlayalım.

Tedaviden iki gün önce, homozigot erkek transgenik zebra balıklarını belirleyin ve onları ayrı çiftleşme tanklarına yerleştirin. Tanklara ayırıcılar ekleyin, ardından her tanka bir vahşi tip dişi balık ekleyin ve balıkları gece boyunca 28 °C'de çiftleşme kafeslerinde bırakın. Ertesi sabah, ayırıcıyı çıkarın. Bir saat sonra, balıkları yeni bir tanka taşıyın ve embriyoları plastik bir süzgece dökün.

Embriyoları E3 çözeltisi içeren 100 milimetrelik kaplara aktarın ve 28 °C'de altı ila sekiz saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından embriyoları bir stereo mikroskop altında inceleyin. Deneyler için uygun olan embriyolar gastrülasyon aşamasında olacaktır.

Bu aşamada, tek hücreli evrede kalan döllenmemiş embriyoları uzaklaştırın. Ayrıca, opak veya şekil bozukluğu görülen canlı olmayan embriyoları da temizleyin. Ardından taze E three solüsyonu ekleyin ve 28 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, benzer evrede ve tekdüze GFP ekspresyonuna sahip transgenik embriyoları seçmek için embriyoları floresan stereo mikroskop altına yerleştirin. 24 HPF embriyoları, yoğun GFP ekspresyonu ile belirgin bir orta beyin-arka beyin sınırı ve GFP pozitif dorsal retinalara sahip iyi oluşmuş gözler gösterir. Bu embriyolar aktiftir; plastik bir pastör pipeti kullanıldığında korionları içinde hareket eder ve kıvranırlar.

24 HPF embriyoları teker teker 96 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın. Bir mikropipet kullanarak, kuyucuklardaki fazla E three solüsyonunu uzaklaştırın. Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak her kuyucuğa 200 µL E three solüsyonu ekleyin.

Ardından, birinci ve 12. sütunlardaki tüm kuyucuklara iki µL DMSO ekleyin. Sonra, DMSO içinde hazırlanmış BCL'yi şu şekilde ekleyin: ikinci ve yedinci sütunlara 1 µM, üçüncü ve sekizinci sütunlara 5 µM, dördüncü ve dokuzuncu sütunlara 10 µM ve onuncu ve on beşinci sütunlara 20 µM.

Beşinci ve onuncu sütunlara mikromolar. Ve son olarak altıncı ve on birinci sütunlara 25 mikromolar ekleyin. Şimdi plakayı alüminyum folyo ile örtün ve 28 °C'de altı saat boyunca inkübe edin.

30 HPF embriyolarını anestezi etmek için her bir kuyuya 10 µL trica ekleyin. Ardından plakayı molecular devices image express ultra open meta express yazılımına yükleyin. 4x objektifli ve maksimum pinhole çaplı bir konfigürasyon seçin.

Plaka tabanını tespit etmek ve önceden belirlenmiş optimal Z ofsetini kullanmak için lazer otomatik odaklamasını yapılandırın. İlgi bölgelerini tespit etmek için tarama alanını, binning yapmadan 2000'e 2000 piksel boyutunda tek bir bölge olarak ayarlayın. Uygun plaka tipini ve 488 nanometre argon lazerini, 488 nanometre uyarım ve 525 nanometre emisyon dalga boyları için seçin.

Ardından, vehikül ile işlem görmüş bir embriyo içeren bir kuyucuk seçin ve örnek bul (find sample) düğmesine tıklayın. Cihaz, bir otomatik odaklama taraması gerçekleştirecek ve görüntüleme işleminin uygun olduğunu onaylamak için tek bir görüntü alacaktır. Rastgele vehikül ile işlem görmüş bir kuyucuk seçin ve bir görüntü alın.

Görüntü netse ve kafada GFP ekspresyonu görülüyorsa; imleci en parlak bölgelerin üzerine getirerek floresan yoğunluğunun 16 bit kameranın 65.000 birimden düşük olan değer aralığında olduğunu doğrulayın.

Bu adımları başka bir araç kontrolü ve birkaç bileşik uygulanmış kuyucuk ile tekrarlayın. Gerekiyorsa, pozitif kontrol görüntülerindeki en parlak bölgelerin doygunluğa ulaşmaması için lazer gücünü ve kazancı (gain) ayarlayın. Ardından, plaka edinme ve kontrol penceresinde, plaka taramasını başlatmak için plaka edin seçeneğini (acquire plate) belirleyin.

Cihaz, tüm mikroplaka için kuyuk başına bir görüntü otomatik olarak elde edecek ve bunları bir SQL sunucu veri tabanında arşivleyecektir. Tarama tamamlandığında, slinger seçeneği etkinleştirilmiş halde geliştiriciyi açarak görüntüleri D tanımındaki geliştiriciye yükleyin.

Yeni bir çalışma alanı oluşturun. Ardından dosya menüsünden özelleştirilmiş içe aktarma seçeneğini seçin. Sonrasında görüntülerin bulunduğu klasöre gidin ve örnek bir dosyayı açın.

Molecular Devices Image Express Ultra platformu tarafından oluşturulan görüntü formatını ve dosya yapısını tanıyan bir içe aktarma filtresi seçin. Görüntüleri işlemek için bir kontrol görüntüsü açın ve istenen bilişsel ağ teknolojisini (cognition network technology) veya CNT algoritmasını veya kural setini yükleyin. Burada kullanılan özel algoritma; embriyoyu, vitellusu ve başı otomatik olarak tanımlamak ve GFP eksprese eden baş yapılarının parlaklığını ve alanını nicelendirmek için tasarlanmıştır; kural setini baş ve vitellus tespit aşamasına kadar çalıştırın.

Vitellüs kesesi ve başın doğru atanmasını sağlamak için, vitellüs çok büyük veya çok küçükse vitellüs tespit eşiğini ayarlamak üzere kural setini değiştirin. Ardından, kural setini parlak baş yapılarının tespit edildiği aşamaya kadar yürütün. Baştaki GFP eksprese eden bölgelerin doğru atanmasını sağlamak için, parlak baş yapılarının tespiti görsel gözlemlerle eşleşene kadar, baş yapıları tespit eşiğini ortalama yoğunluğun katları şeklinde ayarlayarak kural setini değiştirin.

Ardından, araç kontrolü uygulanan embriyolardan oluşturulan rastgele seçilmiş birkaç görüntü ve PCI uygulanan embriyolardan elde edilen pozitif kontrol görüntüleri üzerinde tüm kural setini manuel olarak uygulayın. Algoritmayı tüm plaka görüntüleri üzerinde çalıştırmak için analiz edilecek plakaları seçin ve Analyze'i seçin, ardından optimize edilmiş kural setine gidin ve tüm kuyucukları analiz edin.

Entegre iş zamanlayıcısı kullanılarak, boş kuyucuklar veya belirsiz görüntüler tarama sırasında analizden otomatik olarak hariç tutulacaktır. Sürekli güncellenen bir takip haritası gösterilir. Hem verilere hem de görüntülere, görsel inceleme için çalışma sırasında erişilebilir.

Sayısal veriler ve işlenmiş görüntüler otomatik olarak kaydedilir. Tüm görüntüler analiz edildikten sonra, veriler Excel, GraphPad veya prism gibi üçüncü taraf yazılımlara aktarılabilir. Bu şekil, CNT analizli ve analizsiz, bir araç ile bir BCI ile işlem görmüş kuyucuklardan alınan arşivlenmiş tarama görüntülerini göstermektedir.

Uygulanan yeşil floresan protein veya GFP, transgenik embriyoların gözünde, orta arka beyin sınırında ve trigeminal gangliyonlarında tespit edilir. Hem GFP yoğunluğunun hem de ekspresyon alanlarının genişlediğine dikkat edin. Buradaki BCI ile işlem görmüş embriyolarda, transgenik embriyolardaki GFP raporlayıcı gen ekspresyonu üzerinde BCI'nın doza bağlı bir etkisi görülmektedir.

Yarı maksimal yanıt uyandırmak için gereken konsantrasyon veya EC 50 yaklaşık olarak 12 micromolar idi. Size transgenik zebra balığı embriyolarının nasıl üretileceğini, toplanacağını ve 96 kuyucuklu plakalara nasıl yerleştirileceğini göstermiş olduk. Sinyal yolunun kendi aktivatörüne artan konsantrasyonlarda PCI ekledik.

Ayrıca, transgenik embriyoların görüntülemesinin nasıl otomatikleştirileceğini gösterdik ve görüntüleri, bilişsel ağ teknolojisine dayalı özel olarak tasarlanmış bir algoritma ile analiz ettik. Bu yaklaşımla, bir fibroblast büyüme faktörü sinyalizasyon küçük molekül aktivatörünün etkilerini kademeli bir şekilde nicel olarak ölçebildik. Bu prosedürü uygularken, örnekler arasındaki değişkenliği minimize etmek için embriyoların dikkatle seçilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir.

Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.