Transgenik kullanarak Assaying β-amiloid Toksisite C. elegans Model

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir InVivo model sisteminde beta amiloid peptidin toksisitesini analiz etmektir. Bu analiz yönteminin tekrarlanabilirliği ve nispeten basit olması; ilaçların, çevresel koşulların veya genetik modifikasyonların beta amiloid toksisitesi üzerindeki etkilerinin hızlı bir şekilde test edilmesine olanak tanır. Bu analizin geliştirilmesindeki temel faktör, beta amiloid peptidin kas spesifik ve sıcaklıkla indüklenebilir ekspresyonuna sahip transgenik c. elegans solucanlarının üretilmesidir.

Sıcaklığa duyarlı bu ekspresyon, transgen mRNA'sını mRNA gözetim sisteminin hedefi haline getiren anormal derecede uzun bir üç prime çevrilmeyen bölge içeren bir transgen oluşturularak tasarlanmıştır; bu nedenle, fonksiyonel bir mRNA gözetim sistemine sahip vahşi tip solucanlarda, transgen mRNA'sının degradasyonu nedeniyle bu transgenin ekspresyonu düşüktür. Eğer bu transgen, mRNA gözetim sisteminin temel bir bileşeninde mutasyon içeren bir genetik arka plana aktarılırsa, transgen ekspresyonu önemli ölçüde daha yüksek olacaktır. Genetik arka plan, mRNA gözetim sisteminde sıcaklığa duyarlı bir mutasyon içeriyorsa, bu transgenik suşun uygun olmayan sıcaklıkta çoğaltılması transgen mRNA degradasyonunu engelleyecek ve yüksek transgen ekspresyonu ile sonuçlanacaktır. Beta amiloid peptidinin vücut duvarı kas ekspresyonunu düzenlemek için bu sistemi kullanan transgenik solucanlarda, sıcaklığın 16 °C'den 25 °C'ye yükseltilmesi, beta amiloid peptidinin yüksek birikimine, kas hücrelerinin disfonksiyonuna ve solucanların felç olmasına yol açar; sürenin ölçümü.

Sıcaklık artışı sonrası bu transgenik solucan popülasyonunun felç olması zaman alır. Sıcaklık artışı, beta amiloid toksisitesi için hassas bir analiz yöntemidir. Bu, felç oranlarını etkileyebilecek çevresel değişkenleri en aza indirmeye yardımcı olan, felç analizi için taze nematod büyüme ortamı plakaları hazırlanarak gerçekleştirilir.

İkinci adım olarak, gelişim aşamasının transgen ekspresyonu üzerindeki etkilerini minimize etmek amacıyla transjenik solucanların yaş senkronizasyonlu popülasyonları başlatılır. Ardından, senkronize edilmiş üçüncü larva evresindeki solucanlar 16 °C'den 25 °C'ye yükseltilerek transgen mRNA stabilitesi artırılır ve bu durum beta amiloid peptidinin birikimine yol açar. Her bir solucan için sıcaklık artışından paralize olana kadar geçen sürenin ölçülmesi kas disfonksiyon hızını belirler, böylece beta amiloid peptidi birikiminin toksik etkileri değerlendirilir; bu sayede spesifik tedavilerin endojen olarak eksprese edilen beta amiloid peptidinin toksisitesi üzerindeki etkisini gösteren sonuçlar elde edilir.

Dolayısıyla, ilaç aktivitesini değerlendirmek için transgenik fare modelleri kullanmaya kıyasla tekniğimizin temel avantajı, işlemini çok daha hızlı ve çok daha düşük maliyetle gerçekleştirebilmemizdir. Bu yöntemin görsel olarak gösterimi kritik önem taşımaktadır. Bir felç analizinde L4 solucanlarının skorlanmasını öğrenmek oldukça zordur.

Felçli bir L4 solucanını skorlarken, solucanın baş bölgesinin izole hale hareketine bakmanız gerekir. Baş bölgesi hareket ettiğinde ve solucanın tüm vücudu felç olduğunda, bu solucanı felçli olarak skorlarız. Felç deneyleri, C. elegans çoğaltılması ve genetiği için rutin olarak kullanılan standart nematod büyüme ortamı veya NGM plakalarında gerçekleştirilir.

Plakaları hazırlamak için; sodyum klorür, agar ve peptit içeren NGM çözeltisini bir erlenmeyer flask içerisinde otoklavlayın, ardından ekteki yazılı protokolde belirtilen uygun miktarlardaki steril çözeltileri ekleyin. Her bir 60 milimetre x 15 milimetre Petri kabına 10 mililitre sıvı NGM paylaştırın. NGM'nin oda sıcaklığında gece boyunca katılaşmasını bekleyin.

Bileşiklerin veya ekstraktların etkileri test ediliyorsa, ekstraktı her plakaya paylaştırın ve bir yayma çubuğu kullanarak plaka yüzeyine eşit şekilde dağıtın. Plakaların oda sıcaklığında gece boyunca kurumasına izin verin. Bir mililitrenin üzerindeki hacimlerin kuruması daha fazla zaman gerektirecektir.

Ardından, her plak üzerine LB besiyerinde gece boyunca 0,4 ila 0,6 optik yoğunluğa kadar büyütülmüş 250 µL E. coli suşu OP 50 damlatın ve bakterilerin oda sıcaklığında gece boyunca kurumasına izin verin. Plağın yaşı, paralizi oranı üzerinde önemli bir etkiye sahiptir ve bu nedenle eski plaklar kurumaya meyillidir. Plaklar, paralizi analizinden önce bir hafta içinde dökülmelidir.

İdeal olarak, senkronize yumurta bırakma plakalarınızdan üç ila dört gün önce dökülmüş plakalar kullanmanız önerilir; herhangi bir deneyde kullanılan plakaların tamamı aynı seriden olmalıdır. Bakteri çiminin boyutunun veya bakterinin değiştirilmesi, solucanların davranışını da değiştirecektir. Paraliz analizleri alternatif E. coli suşları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Örneğin, RNAi deneylerinde HT115 kullanılır. Ancak bu durum, paraliz analizinin kinetiğini değiştirebilir.

Bu nedenle, uygun suşlara ait iç kontroller kullanmanız gerekir. Beta kaynaklı paralizi analizleri için en yaygın olarak CL 476 suşu kullanılır. Bu suş ve diğer transgenik modeller, Saint Ahadi Genetik Merkezi'nden akademik araştırmacılara nominal bir ücret karşılığında sağlanmaktadır.

Test popülasyonunun yaş senkronizasyonunu maksimize etmek için, senkronize bir ebeveyn nesli ile başlamak tercih edilir. Test popülasyonunun paralizi deneyini başlatmadan bir hafta önce, platin bir solucan seçici kullanarak 20 ila 30 adet yetişkin bireyi birkaç adet 10 santimetrelik NGM plakasına aktarın.

CL 4 1 76 için uygun sıcaklık olan 16 °C'de, yumurtlama için iki saat boyunca OP 50 ile birlikte yayın. GR yetişkinlerini uzaklaştırın ve dölün yedi gün boyunca büyümesine izin verin; bu süre sonunda ikinci gün gebe yetişkinler haline geleceklerdir. İkinci gün gebeliği.

Her bir deneysel koşul için yaş senkronize test popülasyonları hazırlamak amacıyla yetişkinler kullanılır. Amaç, platin solucan seçici kullanarak 50 ila 75 yaş senkronize solucan içeren üç tekrarlı plakalar oluşturmaktır. Gün iki graver aşamasındaki yetişkinlerden 10 ila 12 tanesini OP 50 damlatılmış 60 milimetrelik NGM plakalarına aktarın. Solucanların 16 °C'de iki saat boyunca yumurta bırakmalarına izin verin, ardından yetişkinleri toplayın ve yumurtaların 16 °C'de açılıp büyümesine izin verin.

Bu aşamada, plakaları değerlendirecek kişi olmayan birinin, değerlendirme işleminin deneysel koşullara karşı körleme yapılması amacıyla plakaları kodlaması en iyisidir. Yumurtaların bırakıldığı embriyonik gelişim evresi (optimal koşullar altında yaban tipi solucanlar için yaklaşık 26 hücre evresidir), erişkin yaşının ve beslenmenin bir fonksiyonudur. Yumurta bırakımı için kullanılan erişkinler daha yaşlıysa veya aç bırakılmışlarsa, daha ileri evreli yumurtalar bırakılacak ve senkronize popülasyon sağlanamayacaktır; bu durum felç deneyi kinetiğini etkileyecektir.

Her türlü bakteriyel kontaminasyon bu analizi ciddi şekilde etkileyebileceğinden, e coli OP 50 gibi monojenik bakteri kültürlerinin kullanılması esastır. Tekrarlı plaklarınızda benzer sayıda solucan bulunması durumunda tekrarlanabilirlik en yüksek düzeydedir. Transgeni indüklemek ve paralizi analizini gerçekleştirmek için plakları 25 °C'ye yükseltin.

Senkronize yumurtlama işleminin sona ermesinden 48 saat sonra solucanlar üçüncü larva evresinde olmalıdır. Plakaların bu sıcaklığa ulaşmasını sağlamak için plakalar, üst üste yığılmadan 25 °C'lik bir inkübatöre yerleştirilmelidir. Aynı zamanda, sıcaklık artırımı başlatıldıktan 18 ila 20 saat sonra solucanların paralizi skorlamasına başlanmalıdır.

Bu noktada, popülasyondaki tüm solucanlar dördüncü larva evresine ulaşmış olmalıdır; her bir plaka üzerindeki tüm solucanlar felç olana kadar iki saatlik artışlarla puanlamaya devam edin. Bilinmeyen nedenlerle felç durumu vücut uzunluğu boyunca homojen değildir. Baş bölgesi, solucanın hareket etmeyi bırakan son kısmıdır.

Bu nedenle, felç durumu yeni başlamış olan solucanlar plaka üzerinde yer değiştiremezler, ancak başlarını hareket ettirebilirler; böylece ön bölgelerindeki bakterileri temizleyerek temizlenmiş bakterilerden oluşan bir hale yol açarlar. Bu solucanlar kaçınılmaz olarak tamamen felç olacaklardır ve bu nedenle halesi olan solucanlar felçli olarak tanımlanır. Bazı solucanların halesi olmayacaktır, ancak bu solucanlar kendiliğinden hareket de sergilemeyecektir.

Bunlar, solucan seçici ile dürtülerek test edilir. Dürtülen bir solucan, dürtülme üzerine tüm vücut boyunca dalga yayılımı gerçekleştiremiyorsa, verimli bir skorlama için o da felçli olarak kaydedilir. Felçli solucanların, bir sonraki skorlama döneminde yanlışlıkla tekrar skorlanmamaları için plakanın işaretlenmemiş bir sektörüne taşınması en kolay yoldur.

Bu durum aynı zamanda yanlış kategorize edilmiş solucanların hareket sergilemesine olanak tanıyarak, bir paralizi eğrisi oluşturmak için skor düzeltmesi yapılmasını sağlar. Her zaman noktasında, her plaka üzerindeki paralize olmamış solucanların oranı yüzdeye dönüştürülür ve ortalama paralize olmamış yüzdesi, sıcaklık artırımı başlatıldığı andan itibaren geçen zamana karşı grafiğe dökülür. Elde edilen eğri biçimsel olarak bir sağkalım eğrisi ile benzerdir ve bu nedenle standart parametrik olmayan sağkalım istatistikleri kullanılarak analiz edilebilir.

Felcin başlayabilmesi için transgenik myo three A beta solucanlarının vites yükseltme işlemi (upshift) L4 evresinin ortasına kadar gerçekleştirilmelidir. Myo three promotörü gelişimsel olarak düzenlenmektedir. Solucanlar geç L4 evresine veya yetişkinliğe ulaştığında, ekspresyon düzeyi önemli ölçüde azalmış olur.

Solucanlar aç bırakılırsa transgenin ekspresyonu engellenir, bu nedenle deney boyunca solucanların iyi beslenmesi oldukça önemlidir. Felç olmuş bir solucanın hiçbir koşulda iyileştiğine rastlamadık. Upshift sonrası 12 ila 16 saat içinde, CL 41 76 suşunda, sıcaklığı tekrar 16 dereceye düşürseniz bile felç meydana gelecektir; transgen ekspresyonunun felce neden olan yukarı regülasyonu daha düşük sıcaklıklarda da gerçekleşebilir.

Ancak, paralizi oranının zamanlamasının etkileneceğini lütfen unutmayın. Paralizi oranı, kullanılan spesifik transgen suşuna bağlıdır. CL 41 76'dan daha hızlı ve daha yavaş paralizi oranına sahip üç farklı myo A beta suşu oluşturduk; bu nedenle, paralizi deneyi için değerlendirme pencerenizi buna göre ayarlamanız gerekmektedir.

Burada, hem işlem görmemiş hem de 6.27 millimolar kafeine maruz bırakılmış CL 4 1 76 için bir felç eğrisi grafiği gösterilmektedir. Bu işlem, yaklaşık dört saatlik, istatistiksel olarak oldukça anlamlı bir felç gecikmesiyle sonuçlanmıştır ve biz bunu beta toksisitesinin baskılandığının bir göstergesi olarak yorumluyoruz. Bu modelde, söz konusu deney kahvede bulunan başka bir bileşiğin etkilerini incelemiştir.

Grafik, beta toksisitesini etkilemeyen uygulamalar için tipiktir. Her iki deneyde de, işlem görmemiş CL 4 1 76 popülasyonlarının yaklaşık yarısının 24. saatte felç olduğuna ve felcin 28. saate kadar tamamlandığına dikkat edin. Bunlar, kontrol grubu felci için tipik zaman dilimleridir.

CL 4 1 7 6 popülasyonlarında bu zamanlamadan meydana gelen belirgin sapmalar, değişmiş çevresel koşulların veya transgen kopyalarının spontan delesyonunun göstergesidir. CL 4 1 76 suşu hakkında ek bilgi için beraberindeki protokole bakınız. Bu prosedürü uygularken plakların yaşı, solucan popülasyonunun evresi ve solucanların paralizi oranını skorlama yeteneğinin göz önünde bulundurulması önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, beta amiloid toksisitesini dikkatli bir şekilde analiz etmek için bu sea elgan sisteminin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız. Çeşitli çevresel veya ilaç tedavilerinin bu toksisite üzerindeki oldukça hafif etkilerini tespit edebilmeniz gerekir. Bahsettiğimiz değişkenlere dikkat etmek önemlidir; çünkü bu, analizi oldukça tekrarlanabilir bir şekilde ve tutarlı bir paraliz kinetiği ile gerçekleştirmenizi sağlayacaktır.

Bu durum, laboratuvarınızda farklı zamanlarda farklı kişiler tarafından elde edilen sonuçları karşılaştırmak veya sonuçlarınızı bu model sistemi kullanan diğer araştırmacılarınkilerle kıyaslamak istediğinizde aslında oldukça önemlidir.