Kararlı İzotopik Profil geliştirilmesi ve Yetişkin Sahne Aracı Metabolik Akı Caenorhabditis elegans

Aşağıdaki deneyin genel amacı; bireysel metabolik yollar, genetik değişiklikler ve/veya farmakolojik tedaviler tarafından tetiklenen glikoliz, piruvat metabolizması ve trisiklik asit döngüsü içindeki gerçek zamanlı metabolik değişimleri, tüm hayvan düzeyinde non-invaziv olarak izlemektir. Bu, ara metabolik yollardaki genetik ve/veya farmakolojik değişikliklerin miktar tayinine izin verecek şekilde, daha fazla metabolitte yeterli izotopik zenginleştirme sağlamak amacıyla canlı nematodlara stabil izotoplar verilerek gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, atmosferik ve çözünmüş karbondioksitteki izotopik birikim, kısa süreler boyunca ara metabolik fluksun daha doğrudan değerlendirilmesini sağlayan gaz oranı kütle spektrometrisi ile ölçülür.

Ardından, nematodlardaki metabolik akı değişimini nicelleştirmek amacıyla, örnekler HPLC kullanılarak tüm solucan serbest amino asit analizi ile GCMS kullanılarak amino asitler ve organik asitlerdeki izotopik zenginleştirme için işlenir. Stabil izotop maruziyetinin ardından, ara metabolitlerdeki izotopik bolluğu sorgulamak için yabani tip solucanlarda değişken izotop maruziyet sürelerinin, bakteriyel temizlemenin ve alternatif solucan parçalama yöntemlerinin etkilerini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem, ara metabolizmaya dair içgörü sağlayabilir.

Ayrıca memeli hücre hatları ve dokular gibi sistemlerimize de uygulanabilir. Bu yöntemle ilgili ilk fikri, primer solunum fonksiyonu değişikliklerinde ara metabolik akışın bozulduğuna işaret eden, HPLC ile yapılan serbest solucan amino asit analizlerinde tutarlı anormallikler gözlemlediğimizde edindik. Bu prosedüre başlamak için.

Gelişim sürecinde veya yetişkinlikte stabil izotopla işaretlenmiş metabolik öncüle maruz bırakılan solucanlar, 1,5 mililitrelik plastik bir santrifüj tüpüne toplanır. Genellikle solucanları mililitre başına 1000 solucan konsantrasyonuna seyreltiriz. İç standart olarak epsilon aminokaproik asit içeren %60 perklorik asidi, solucanlara %4 perklorik asit ve 20 nanomolar iç standart son konsantrasyonu olacak şekilde ekleyin.

Solucanın yerçekimi ile çökmesi için beş dakika bekleyin, ardından süpernatantı uzaklaştırarak başka bir tüpe kaydedin. Bir sonraki adım, bu prosedürün en kritik yönlerinden biridir. Serbest metabolit analizinden önce solucanların eleme yoluyla tamamen parçalanması gerekir. Plastik bir homojenizatör ve motorlu matkap kullanarak, solucan örneklerini 15 saniye boyunca öğütün.

Solucan parçalanmasını ışık mikroskobu ile görsel olarak doğrulayın ve gerekirse öğütme işlemini tekrarlayın. Bu görüntüde, A ve B panelleri öğütme öncesindeki solucanları göstermektedir. Öğütme sonrası solucanları gösteren C ve D panellerinin aksine, daha önce saklanan süpernatantı solucan Homojenat santrifüjü ile 1,5 mililitrelik plastik santrifüj tüplerine aktarın.

Örnekleri 2.250 RPM 1300 Gs hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, süpernatanı taze bir yedi mililitrelik cam tüpe aktarın. Peleti, daha sonra bir protein konsantrasyon analizi için kullanmak üzere saklayın.

Şimdi, örneklerin pH aralığı yedi ile sekiz olana kadar süpernatana dört normal potasyum hidroksit ekleyin. Tuzları uzaklaştırmak için, yedi mililitrelik cam tüplerdeki nötralize edilmiş örnekleri 2.250 RPM 1300 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve her örneğin süpernatanını yeni bir yedi mililitrelik cam tüpe aktarın. Nötralize edilmiş örnekler artık yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya HPLC ve gaz kromatografisi, kütle spektrometrisi veya GCMS ile metabolit kantifikasyonu için hazırlanabilir; HPLC için.

Nötralize edilmiş her örneğin 50 µL'sini HPLC'ye doğrudan enjekte etmek üzere ayırın. Serbest amino asit miktar tayini, bir aldehit ile ön kalibrasyon türevlendirmesi ve floresan deteksiyon kullanılarak gerçekleştirilir. Daha önce açıklandığı üzere, geri kalan nötralize edilmiş örnekler, bir sonraki Bölümde gösterildiği gibi amino asitler ve organik asitlerdeki izotopik zenginleşmeyi belirlemek amacıyla GCMS için iyon değişim reçinesi kullanılarak ekstraksiyona tabi tutulacaktır.

Boncukları hazırlamak için, G1 ve G50 boncuklarına ayrı ayrı normal hidroklorik asit ekleyin. Bir litrelik beherlerde, her bir flaskı manyetik karıştırıcı ile 30 dakika boyunca karıştırın. Ardından, yıkama sularının pH değeri suyun pH değerine eşitlenene kadar boncukları 10 kez deiyonize su ile yıkayın.

Ardından, cam pipetler kullanarak düşük maliyetli özel kolon hazırlama yöntemimizi göstereceğiz. Hazır kolonlar ticari olarak da temin edilebilir. Kolon hazırlamak için, bir penset yardımıyla pastör pipet ucunun en dar kısmının hemen üzerine bir pamuk tıkaç yerleştirin; organik asit ekstraksiyonu için G 1 boncuklar ve G 50 boncuklar kullanın.

Amino asit ekstraksiyonu için, her kolonu yaklaşık olarak kolon yüksekliğinin üçte birine kadar doldurun. Örnek halihazırda nötr pH değerindeyse, AG one kolonuna uygulanmadan önce örneğe hiçbir şey eklenmez. Amino asitleri ekstrakte etmek için organik asitleri ekstrakte etmek amacıyla, örneği AG 50 kolonuna uygulamadan önce örneğe bir mililitre 0.1 normal hidroklorik asit ekleyin.

Şimdi, önceden hazırlanmış nötralize edilmiş örnekleri her bir kolona uygulayın. Yıkama işlemleri nötr olana kadar her bir kolonu su ile 10 kez yıkayın. Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, her bir kolonu etiketlenmiş taze dört mililitrelik cam örnek şişelerine elüye edin. Organik asit ekstraksiyonu için AG 1 kolonuna üç mililitre üç normal hidroklorik asit ekleyin.

Bu durum, üç karbonlu türler, dört karbonlu türler, beş karbonlu türler ve altı karbonlu türler arasındaki toplam işaretli karbon sayısındaki izotop zenginleşmesinin analizine olanak tanır. Amino asit ekstraksiyonu için, G 50 kolonuna üç mililitre dört normal amonyum hidroksit ekleyin. Bu durum, üç karbonlu türler ve beş karbonlu türler arasındaki toplam işaretli karbon sayısındaki izotop zenginleşmesinin analizine olanak tanır.

Hem organik asit hem de amino asit ekstraksiyonları tamamlandığında, numune tüplerini kuruyana kadar gece boyunca bir reaktif app üç evaporatöre yerleştirin. Numuneler daha sonra Protokol metninde ayrıntıları verildiği üzere türevlendirilmiş ve GCMS ile analiz edilmiştir. Bu prosedüre, bin adet genç yetişkin solucanı, evrensel olarak etiketlenmiş karbon 13 glukoz ve e coli içeren deneysel 35 milimetrelik bir NGM agri plakasına aktararak başlayın.

Ardından, kapağı açık olan deneysel NGM plakasını yerleştirin. Hassas atmosfer örneği alımı ve değişimi sağlamak için sızdırmaz bir üç yollu muslukla donatılmış özel bir cam hazne kullanın. Optik olarak şeffaf cam diskin plaka üzerine oturduğu sızdırmazlık bölgesini yüksek vakum gresi ile kaplayın.

Hazneyi cam disk ile mühürleyin. Saati kaydedin. Sıfırıncı an olarak, 30 dakika sonra, üç yollu musluk vasıtasıyla cam haznedeki atmosferden 10 mililitre örnek almak için 20 mililitrelik bir şırınga kullanın.

Hazerine giden musluğu kapatın. Örnekleme yaptıktan sonra, örneği 0,1 molar sodyum hidroksit içinde bir mililitre sodyum bikarbonat içeren kırmızı kapaklı vakumlu cam tüpe aktarın. Ardından, üç yollu musluk aracılığıyla cam hazneye 10 mililitre hava enjekte edin. 20 mililitrelik bir şırınga kullanarak hazneye giden musluğu kapatın. Atmosferi yeniden enjekte ettikten sonra ve inkübasyona devam etmeden önce; 60, 90 ve 120. dakikalarda cam hazneden atmosfer örneklemesini tekrarlayın.

Protokol metninde açıklandığı üzere, bu atmosferik karbondioksit örneklerini bir gaz oran kütle spektrometresi kullanarak işaretli karbon zenginleşmesi açısından analiz edin; burada, canlı veya UV ile ışınlanarak öldürülmüş OP 50 e coli ile beslenen solucanlardaki çözünmüş solucan karbondioksitinde ve atmosferik karbondioksitte ölçülen işaretli karbonla kanıtlandığı üzere, stabil izotoplar iki saat sonra genç yetişkin solucanlara iyice dahil olmuştur. Karbon 13 karbondioksitin karbon 12 karbondioksite oranı, salınan atmosferik karbondioksite kıyasla çözünmüş solucan karbondioksit fraksiyonunda daha yüksekti. Larval dönemden itibaren bir stabil izotopa uzun süreli maruz kalmanın ve ardından solucanların bakteri içermeyen NGM ağartma ortamında temizlenmesinin, genç yetişkin solucanlardaki serbest glutamatın izotopik zenginleşmesini artırdığı gözlemlenmiştir.

Bu grafikte, L1, L1 larva evresinden 959 hücreli genç erişkin evresine kadar evrensel olarak işaretlenmiş karbon 13 glikoz ve OP 50 bakterileri ile beslenen solucanları temsil eder; YA ise yumurtlama evresinin ilk gününe ulaştıkları andan itibaren 48 saat boyunca karbon 13 glikoz ve OP 50 bakterileri ile beslenen solucanları temsil eder. X ekseni, her bir glutamat türündeki toplam işaretli karbon atomu sayısını, Y ekseni ise yüzde zenginleşmeyi göstermektedir. Tüm hayvanlar, sonraki numune hazırlama işlemleri öncesinde fazla izotopik etiketten arındırılmıştır.

GCMS analizleri için yeşil çubuklar, PCA ekstraksiyonundan önce iki saat boyunca NGM plaklarında OP 50 E coli ile beslenerek izotopik maruziyete tabi tutulan ve ardından temizlenen solucanları göstermektedir. Mavi ve gri çubuklar ise izotopik maruziyet süresinden bağımsız olarak, PCA ekstraksiyonundan önce sırasıyla iki veya altı saat boyunca bakteri içermeyen NGM plaklarında izotopik maruziyete tabi tutulan ve ardından temizlenen solucanları göstermektedir. Hayvanlar plaklarda iki veya altı saat boyunca temizlendiğinde, ara metabolitlerdeki izotopik zenginleşmede anlamlı bir fark gözlemlenmemiştir.

Her iki izotopik maruziyet sürecinde, hayvanlar iki saat boyunca işaretlenmemiş bakterilerle beslenerek temizlendiğinde, ara metabolitlerde daha düşük izotopik zenginleşme gözlemlenmiştir. Bu nedenle, bakteriyel yayma yapılmış izotop içeren N GM plaklarında büyütülen solucanlar için ara metabolitlerdeki yüzde zenginleşmeyi optimize etmek adına, en uygun temizleme protokolünün yayma yapılmamış NGM plaklarında iki saatlik temizleme olduğu belirlenmiştir. Bakterisiz ortamda, sıvı kültürde yirmi dört saat boyunca tek bir altı karbon 13 glikoz ile tedavi uygulandıktan sonra.

Bu şekilde gösterildiği üzere, yalnızca sonikasyonla veya sonikasyon artı öğütme ile parçalanan solucan örneklerinin bir karşılaştırması yapılmıştır. Sonikasyon artı öğütme ile parçalanan solucanlar, yalnızca sonikasyonla parçalanan örneklere göre daha yüksek izotopik zenginleşmeye sahipti; sonuç olarak canlı solucanlar, ya plakalar üzerinde L1 evresinden itibaren gelişim sırasında ya da genç yetişkinler olarak sıvı kültürde yumurtlama gününden itibaren 24 saat boyunca kararlı bir izotopik öncü ile beslenmiştir. Bu yöntem, glikoliz ve trikarboksilik asit Döngüsü'ndeki piruvat metabolizması üzerinden gerçekleşen akışı belirten metabolitler arasındaki izotopik zenginleşmenin hassas analizine olanak tanır.

Bu teknik, C. elegans'ta ara metabolik akışın araştırılması için mitokondriyal hastalık araştırmalarına zemin hazırlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, nematodlar olan C. elegans'ta ara metabolizmanın ve metabolik akışın kararlı izotopik profillemesinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.