Temel

Bu videoda, C. elegans'ı birinci larval evrede nasıl senkronize edeceğinizi göstereceğiz. Bu basit ancak oldukça yaygın kullanılan bir yöntemdir, bu nedenle oldukça faydalı olacaktır. Hala başlangıç aşamasındasınız.

Eğer C konusunda uzmansanız, burada bu protokolü optimize etmek için bazı ipuçları bulabilirsiniz. Solucanların senkronizasyonunun temeli, clen ve embriyoların alkali hipoklorit çözeltisine karşı yetişkin tavşanlara göre gösterdiği göreceli dirence dayanmaktadır. İçlerinde çok sayıda embriyo bulunan bu yetişkin solucanlar, ölmeleri ve yalnızca embriyoların kalması için bir hipoklorit çözeltisi ile inkübe edilir.

Senkronizasyonun ikinci kısmı, embriyolar farklı zamanlarda yakalansa bile L1 aşamasından daha ileriye gelişmemeleri için gıda eksikliğiyle sağlanır. Bir blitzing protokolünü başlatmanın ilk adımı, solucanların yumurtlama aşamasında olması ve plakaya birkaç yumurtanın dağılmış olmasıdır. Hasat etmek amacıyla yetişkinleri geri kazanmak için M9 kullanın.

Ayrıca, plaka yüzeyinde bulunan embriyolar, bir röntgen filmi parçası gibi yumuşak bir materyalle sıyrılabilir ve geri kazanılan bakteriler birkaç kez M9 yıkamasıyla uzaklaştırılabilir. Genellikle birkaç yıkama yeterlidir. Solucanlar yıkandıktan sonra, tercihlerimize göre taze hazırlanmış ağartma çözeltisini ekleme zamanı gelmiştir.

Tüpü sallarken inkübasyon süresini kontrol edin. Erişkinlerin oluşumunu stereo mikroskop altında izleyebilirsiniz. Neredeyse hiç karkas kalmadığında, tüp tamamen dolana kadar M nine ekleyerek reaksiyonu durdurun.

Protokolü tamamlamak için en az üç yıkama işlemi gerçekleştirin. Yumurtalar, M9 tamponu içerisinde gece boyunca sürekli ajitasyonla inkübe edilir; bu işlem yumurtaların açılmasına izin verirken solucanların daha fazla gelişmesini önler. Senkronizasyon 15 ile 25 derece arasındaki herhangi bir sıcaklıkta gerçekleştirilebilse de, 15 derece önerilir.

Gelişim daha yavaş olduğu için, gelişim süreci boyunca belirttiğimiz üzere, C. elegans yetişkinliğe erişmeden önce, yetiştirildiği sıcaklığa bağlı olarak dört larva evresinden geçer. C tipi C. elegans 15 ile 25 derece arasındaki büyüme sıcaklıklarına tolerans gösterirken, büyüme hızı bu aralıkta daha yüksektir.

Buradaki yüksek sıcaklıkta, 24 saat sonra solucanların bulunduğu evrelerin nasıl farklılaştığını görebilirsiniz. 15 ve 25 derecelerde, 25 derecede 48 saat sonra halihazırda embriyolar gözlemliyoruz. Ancak, plakların yüzeyinde embriyoları görmek için 80 saatten fazla beklememiz gerekiyor.

Optimal sonuçlar elde etmek için 15 °C'de yetiştirilen solucanlarla blitzing deneyi yaparken birkaç husus göz önünde bulundurulmalıdır. Ayrıca, deneyin gerçekleştirilmesi için solucanların istenen evrede olduğunun belirlenmesi önemlidir. Bu nedenle, evrelerin boyut, diferansiyel girişim kontrast mikroskobu veya boyama yöntemiyle nasıl ayırt edileceğini size göstereceğiz.

Bu grafikte, GaN solucanlarının sıcaklığa bağlı büyüme oranını görebilirsiniz; örneğin, 25 derecede çok daha hızlı büyüdükleri görülmektedir. Deniz elementlerinde hayvan boyutu ile gelişim arasında bir korelasyon vardır. Uygun yazılım kullanılarak hayvanlar ölçülebilir ve ardından uygun gelişim evresine göre sınıflandırılabilir.

Ancak bu grafiğe göre, bölge gelişim aşamalarının genel bir belirtecidir. Diferansiyel girişim kontrast mikroskobisi veya DPI boyaması ile gözlemlenebilen ve tanınabilen anatomi kısımları izlenerek daha üzerinde uzlaşılmış bir evreleme gerçekleştirilebilir. Laboratuvarımızda bu protokolü; tekli boyamada mikro yumurtalar, in situ görselleştirme ve apikal boyama gibi farklı deneyler için solucanları senkronize etmek amacıyla kullandık.

Ayrıca, bu Protokol kontaminasyonu önlemenize de yardımcı olur. Kontrastı artırmak için diferansiyel girişim kontrastı veya nomar mikroskopisi kullanılır. Boyanmamış şeffaf örneklerde, hayvanlar %2 Agros tabanı üzerine canlı olarak monte edilir; Agros önceden hazırlanabilir ve gerektiğinde dört derecede saklanabilir.

Eritilip 65 derecede tutulabilir. Agaroz eridiğinde, bir lama bant yapıştırın ve bunları üçüncü bir lamın her iki yanına yerleştirin. Dikkatlice bir miktar agaroz alın ve bantlanmamış lamın üzerine bir damla damlatın.

Agro plakalarını, enlemesine yerleştirilmiş başka bir lamla kapatın. Yol katılaştığında, lamların birini diğeri üzerinde dikkatlice kaydırarak iki lamı birbirinden ayırın. Pedlerden biri lamlardan birine yapışacaktır.

Solucanların hareketsiz kalmasını sağlamak için pedin üzerine bir miktar Amazon ekleyin. Diseksiyon mikroskobu altında bazı solucanları seçin ve onları lele damlasına aktarın. Yola zarar vermekten kaçının.

Bir lamel alın ve kenarlarına biraz oje sürün. Hava kabarcığı oluşumunu önleyerek lameli lam üzerine dikkatlice yerleştirin. Hazırlanan örnek mikroskop altında hemen gözlemlenebilir. C. elegans anatomisinin en kolay ayırt edilen özelliklerinden biri farenksdir.

Örneğin, Noel ağacı şeklindeki aava, L4 evresinin karakteristiğidir. Gelişim boyunca c. elegans anatomisine ilişkin ayrıntılı bilgilere www.orla.org adresinden ulaşılabilir. Hücreleri tanımlamak için yaygın bir prosedür olan Tapis boyaması kullanılır.

Tünel ile fiksasyon, solucanları sabitlemek için hızlı bir yöntemdir. DAPI boyaması için, önce mikroskop lamının yüzeyine bir damla M9 tamponu ekleyin. Plakadan doğrudan bazı solucanları alın ve bunları M9 damlasına aktarın.

Fazla M9'u bir pipetle veya yumuşak bir dokuyla temizleyin. Solucanlara bir tünel ekleyin. İşlemi tekrarlayın.

İlk damla kuruduktan sonra, preparatı mikroskoba götürmeden önce API ve oversleep içeren montaj medyumu ekleyin. Go gelişimi, api içeren sıcak stent ile kolayca gözlemlenebilir.