Membran Potansiyelleri, Synaptic Yanıtları, Sinir Devresi, Nöromodülasyon ve Kerevit kullanarak kas Histoloji: Öğrenci Laboratuvarı Egzersizler

Aşağıdaki deneylerin genel amaçları, uyarılabilir membranların özelliklerini ve dinlenme membran potansiyelinin iyonik temelini anlamak, membran potansiyelini ölçme yöntemlerini öğrenmek ve sinaptik iletimin özelliklerini göstermektir. Deneyin bir bölümünde, hücre dışı potasyum değiştirilirken dinlenme membran potansiyeli ölçülecektir. Deneyin diğer bir bölümünde ise, çeşitli motor ünitelerde uyarılmış sinaptik yanıtlar kaydedilerek sinaptik farklılaşma mekanizmaları incelenecektir.

Ardından, bakımı kolay olan bir nöral devre sunulmaktadır. Bu hazırlık, duyusal birimden MSS'ye, oradan motor nörona ve kasa uzanan bir devrenin çeşitli yönlerini araştırmak kadar öğretmek amacıyla da kullanılabilir. Bu deney seti; membran potansiyeli, sinaptik entegrasyon ve iletim ile kas lifi türlerinin yapısal farklılıklarına ilişkin konuları ele almak için kerevit modelini kullanmanın kolaylığını göstermektedir.

Elektrofizyolojik kavramların ve tekniklerin öğretiminde kerevit hazırlığının kullanılmasının temel avantajları; diseksiyonun kolaylığı, hazırlığın minimum salin ile yaşayabilirliği, sinaptik yanıtların elde edilme kolaylığı ve kasların genel anatomik düzenlemesinin kolayca ayırt edilebilmesidir. Bu teknikler diğer hazırlıklara da uygulanabilir ve sinaptik fizyoloji ve modülasyonun yanı sıra gösterilen hazırlıktaki biyokimyasal ve yapısal farklılıklar konusundaki anlayışımızı geliştirecektir. Cerrahi işleme başlamak için vücut uzunluğu yaklaşık altı ila 10 santimetre olan bir kerevit seçin ve anestezi uygulamak için beş dakika boyunca kırılmış buzun içinde bekletin; kereviti başsız bırakmak için, büyük bir makas kullanarak parmaklarınızın kerevitin kıskaçlarından ve ağzından uzak olduğundan emin olarak başın arkasından tutun.

Kerevitin gözlerinin arkasından temiz bir kesi yaparak başını hızlıca çıkarın, yaralanmaları önlemek için kerevitin bacaklarını ve kıskaçlarını temizleyin. Erkeklerde stilleri, hem erkeklerde hem de dişilerde yüzücü ayakları çıkarın. Baş ve uzuvları imha edin.

Ardından, abdomen ve toraksı birbirine bağlayan eklem zarını boyunca bir kesi yaparak abdomeni torakstan ayırın. Kerevitin abdominal kısmını saklayın ve toraksı atın; makası hafifçe ventral tarafa doğru aşağıya ve belirli bir açıyla yönlendirerek, abdomenin her iki yanının alt lateral kenarı boyunca kabukta bir kesi yapın. Kereviti çok derin kesmemeye dikkat edin.

Penset kullanarak, kerevizin her bir segmentinin uzunluğu boyunca uzanan doğal kabuk çizgi desenini takip edin. Karın kaslarına zarar vermemeye dikkat ederek, kabuğun ventral kısmını yukarı ve geriye doğru çekerek çıkarın.

Fleksör kasları çıkarın. Bu noktada, derin fleksör kasların üzerinde beyaz bir doku kitlesi görülebilir. Bu dokuyu pens ile dikkatlice çıkarın.

Gİ kanalı, derin fleksör kasların orta hattı boyunca uzanan küçük bir tüp şeklinde görünür hale gelir. Üst kısmından pensle sıkıştırıp karından uzaklaştırarak çıkarın. Gİ kanalının alt kısmını kuyruğun bittiği yerden kesin.

Fekal atıkların preparasyona müdahale etmediğinden emin olmak için diseksiyon bölgesini salin ile durulayın. Preparasyonun üst ve alt köşelerini, diseksiyon iğneleri kullanarak S guard kaplı bir Petri kabına sabitleyin. Abdominal ekstansör kaslar şu an açığa çıkmış durumdadır.

Hücre içi kayıtlar gerçekleştirilene kadar hazırlığı kaplayacak şekilde Petri kabına salin solüsyonu dökün. Petri kabını mikroskoba taşıyın ve kabın hareket etmesini önlemek için altına balmumu sürün. Hücre içi kayıtlar için kullanılan düzenek bu şekilde gösterilmiştir.

Uygun bağlantılar ve ayarlar ekteki metinde verilmiştir. Laboratuvar şeması yazılımını talimatlara göre kurun. Ekteki metinde, toprak telini saline banyosuna yerleştirin.

Üç molar potasyum klorür ile doldurulmuş bir cam mikro pipetin ucunu salin banyosuna yerleştirin ve elektrot direncini test edin. Elektrot direnci 20 ila 60 mega ohm arasında olmalıdır. Yüksek yoğunluklu aydınlatma altında, laboratuvar grafiğindeki çizgiyi sıfıra getirmek için amplifikatör üzerindeki kaba ayar düğmesini kullanın.

Mikroskoptan bakarak longitudinal DEM kaslarını belirleyin. Hücre içi elektrodu DEM kasının bir kas lifine yerleştirmek için elektrot probunu kullanın. Elektrot, kas lifine çok az miktarda yerleştirilmelidir.

Hücreyi tamamen delmemeye dikkat edin. Dinlenme potansiyelinin genliğini ölçün. M imlecini, grafik penceresinin sol alt köşesindeki konumdan iz üzerinden sürükleyin.

M işaretçisini baz hattına yerleştirin ve imleci kaydedilen sinyalin en düşük noktasına getirin. İşaretçi ile aktif imleç arasındaki fark ekranın sağ üst köşesinde görüntülenir. Bu değer, dinlenim membran potansiyelinin voltajıdır.

Kaydedilen voltajı, bu durumda 10 x amplifikasyon kullanıldığı için, amplifikasyon miktarına bölün. Ardından voltajı volt cinsinden milivolt cinsine dönüştürün. Söz konusu kas lifi için dinlenim potansiyeli kaydedildikten sonra, mikroskoptan bakarak elektrodu kas lifinden dikkatlice çıkarın.

Hücre içi kaydın işlemini diğer kas liflerinde tekrarlayın. Bu deneyin sonraki bölümünde, hücre dışı potasyum konsantrasyonunun artırılmasının dinlenme membran potansiyeli üzerindeki etkisi izlenecektir. 5.4, 20, 40, 60, 80 ve 100 milimolar potasyum konsantrasyonuna sahip altı farklı kerevit salin çözeltisi kullanılacaktır.

Kayıtlar arasında bir sonraki hücre içi kaydı yapmak için seğirmeyen bir kas seçin. Banyosunu, bir sonraki daha yüksek konsantrasyonlu potasyum klorür çözeltisiyle değiştirin. Her seferinde preparasyonun tamamen kaplandığından emin olun.

Her bir çözelti için membran potansiyelindeki değişimleri kaydedin. Hücre dışı potasyum konsantrasyonunun artırılmasının etkisiyle oluşan membran potansiyeli bu ekran görüntüsünde gösterilmiştir; her bir potasyum konsantrasyonu için dinlenme membran potansiyellerini, hücre dışı potasyum konsantrasyonuna karşı membran potansiyelini gösteren yarı logaritmik bir grafiğe aktarın. Dinlenme potansiyelini 5.4 millimolar hücre dışı potasyum değerine göre hizalayın.

Hipotez ve gözlem eğrileri için, gözlem çizgisinin eğimini hipotez çizgisinin eğimiyle karşılaştırın. Bu elektrofizyolojik kayıtları tamamladıktan sonraki adım, kas liflerinin anatomisini ve innervasyon modellerini incelemektir. Hazırlığı dik duruş kabına aktarın ve metilen mavisi ekleyin.

Beş dakika sonra metilen maviyi uzaklaştırın ve taze kerevit salini ekleyin. Bir segment içindeki kasları innerve eden ana siniri bulun. Bir segmentteki S-E-M-D-E-L 2D EL bir ve DEM kaslarına giden innervasyon paternini taslak olarak çizin.

Ardından, hazırlığı bir çeker ocak altına taşıyın. Salini uzaklaştırın ve fiksatif ekleyin. Burada kullanılan fiksatif, bir poin çözeltisidir.

Çeker ocak kullanımının amacı, tespit edici maddenin buharlarından kaçınmaktır. Bu çözeltinin cildinize veya gözlerinize temas etmemesi için çok dikkatli olun. Gözlerinizde yanma hissederseniz, gözlerinizi hemen göz duşunda yıkayın.

Boin solüsyonunun preparat üzerinde yaklaşık 10 dakika kalmasını sağlayın ve ardından solüsyonu serum fizyolojik ile değiştirmek için bir pipet kullanın. DEL bir veya DEL iki kasından ince bir segment kesin. Bunu bir lam üzerine yerleştirin.

Lamı etiketleyin. Aynı prosedürü SEM kası için tekrarlayın. Her iki doku preparatındaki sarkomer bantlanma paternini görüntülemek için bileşik mikroskobu kullanın.

Bir sonraki deney serisi,tenya abdominal kaslarındaki sinaptik yanıtların nasıl kaydedileceğini inceleyecektir. Başka bir crayfish seçin ve kafasını kesin. Toraksı ve ekstremiteleri çıkararak abdominal ekstansör kasları cerrahi işlemde gösterildiği gibi açığa çıkarın.

Bu videonun ilk bölümünde, mikroskop kullanarak extensor kaslara motor aksonları taşıyan siniri bulun. En kolay erişilebilir sinire sahip segmenti arayın. Sinir beyaz renktedir ve preparasyon üzerine bir pipet yardımıyla salin püskürterek veya preparasyona hafifçe üfleyerek görülebilir.

Bu işlem sinirin hareket etmesini sağlar ve böylece tanımlanmasını kolaylaştırır. Mikromanipülatörle tutulan vakum elektrodunu doğrudan sinirin üzerine yerleştirin. Siniri elektrodun içine çekmek için şırıngayı nazikçe geri çekin.

Sinirin elektrot içine çekildiğini mikroskop aracılığıyla görebilirsiniz. Laboratuvar çizelge yazılımındaki ayarları, beraberindeki makalede belirtildiği şekilde düzenleyin. Üç molar potasyum klorür içeren bir cam mikro elektrot doldurun ve bunu baş aşamasına (head stage) ve power lab'e bağlayın.

Laboratuvar grafiğindeki çizgiyi sıfıra getirmek için amplifikatör üzerindeki kaba ayar düğmesini kullanın. Elektrot yerleştirilmeden önce, açma-kapama düğmesi birkaç kez açılıp kapatılmalıdır. Elektrot direncini test etmek için, elde edilen değerlerin genliğini ölçün.

Mikroskoptan bakarak, elektrot probunu kullanarak elektrodu longitudinal kas liflerinden birine, DEM veya DL1 ya da DL2'ye yerleştirin. Kas lifini tamamen delip geçmemeye dikkat edin. Preparat artık deney için hazırdır.

Vakum elektrodu segmental sinir demetini stimüle etmek için kullanılır ve cam mikro elektrot, kas lifinden gelen sinaptik yanıtı kaydetmek için kullanılır; fazik yanıtlar için siniri 1 Hz frekansında stimüle etmek üzere graft stimülatörü tetiklenir. Ardından, elektrodu bir SEL kas lifine yerleştirin. SEL tonik bir kastır.

Tonik yanıtlar elde etmek için siniri 10 hertz'de kısa pulse patlamaları ile stimüle edin. DEL ve SEL kaslarının kaydedilen yanıtlarını karşılaştırın. Fazik DEL kaslarının, tonik SEL kaslarına göre daha büyük amplitüdde sinaptik yanıtlar verdiğine dikkat edin.

Sıradaki deney seti, ekstansör kaslardan ziyade kerevitin fleksör kaslarına odaklanmaktadır. Yeni bir kerevitle başlayarak, bu cerrahi işlemde gösterildiği gibi abdomeni izole edin. Bu videonun ilk bölümünde, izole edilmiş kuyruk preparatını salinle doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin, kuyruğu ve preparatın üst kısmını iğnelerle sabitleyin.

Tonic fleksör kaslar üzerindeki dec Caro deneylerinde, ventral sinir kordonunun sağlam bırakılması gerektiğini unutmayın. Preparasyonun ventral tarafındaki iki kaburga arasındaki eklem membranından boylamsal bir kesi yapmak için bir bistüri kullanın. Yüzeysel kasların zarar görmediğinden emin olmak için bu kesiyi yaparken çok derin kesmemeye dikkat edin; çünkü derin bir kesi motor sinir kökünü kesebilir.

Sonraki adımı uygulayın. Bir mikroskop altında, makas veya bisturi kullanarak, kası örten ince membran tabakasında boyuna kesi boyunca yatay bir kesi yapın. Eklem membranından bir flep oluşturmak için kesiyi genişletin ve flebi yukarı doğru kaldırın.

Yüzeyel fleksör kaslardan hücre içi kayıt yapabilmek için, bu kasları açığa çıkaran kapakçığı makasla kesin. Dinlenme membran potansiyelini ve abdominal ekstansörlerden gelen sinaptik yanıtları kaydetmek için kullanılan düzenek ve araçların aynısını kullanın. Daha önce olduğu gibi, üç molar potasyum klorür ile doldurulmuş bir hücre içi elektrot kullanın.

Elektrodu, kası tamamen delip geçmemeye dikkat ederek, yüzeysel fleksör kasların bir kas lifine yerleştirin. EPSP'lerin spontan aktivitesini kaydedin. EPSP'lerin farklı boyutlarını ve varsa herhangi bir IPSP'nin varlığını not edin.

Küçük bir boya fırçası alın ve kayıt elektrodunun bulunduğu segment içindeki kütikül kenarı boyunca dikkatlice fırçalayın. Daha güçlü bir yanıt gözlemlenirse, uyarılmaya bağlı olarak EPSP'lerin frekansında veya boyutunda meydana gelen herhangi bir değişikliği not edin. Bu durum, duyusal sinir ateşlemesindeki değişime yanıt veren ek motor nöronların devreye girdiğini gösterir.

Salin banyo çözeltisini, 1 µM serotonin gibi bir nöromodülatör içeren veya karbon dioksit ile köpürtülmüş salin içeren bir çözeltiyle dikkatlice değiştirin. Ardından fırça stimülasyonunu tekrarlayın. Banyo çözeltisinin değiştirilmesinin kaydedilen aktivite üzerindeki etkesini not edin.

Banyo tuzlu suyunu tekrar normal tuzlu suyla değiştirin ve kas lifi aktivitesinin bazal seviyeye döndüğünü gözlemleyin. Bu şekil, yüzeysel bir fleksör kas lifinde kaydedilen EPSP'leri göstermektedir. EPSP'lerin farklı boyutlarına dikkat edin.

Bu deneyin bir sonraki aşamasında, duyusal sinirlerden merkezi sinir sistemine ve oradan motor nöronlara uzanan devredeki aktiviteye yanıt veren motor nöronların aksiyon potansiyellerini izlemek için hücre dışı bir elektrot kullanılır. Duyusal sinirleri uyarmak için bir vakum elektrodu hazırlayarak başlayın. Bir parça plastik tüpü alev üzerinde ısıtarak daraltın.

Bir sonraki adım, tüpü istenen boyuta göre kısaltmaktır. Bunu yapmak için, vakum elektrodunuz için istenen açıklık çapını belirlemek amacıyla hazırlığınızdaki sinire bakmanız gerekecektir. İstakozun boyutuna bağlı olarak, sinir demetlerinin çapı yaklaşık bir milimetreden birkaç milimetreye kadar farklılık gösterebilir.

Siniri tutmak için uçtaki açıklığı uygun boyuta getirmek amacıyla tüpün gerilmiş kısmını kesin. Açıklık çok geniş olursa sinir dışarı çıkabilir. Açıklık çok dar olursa sinir, elektrodun uyguladığı basınç nedeniyle zarar görebilir.

Plastik tüpü, cam bir vakum elektrodunun ucuna yerleştirin. Elektrofizyoloji ve yazılım kurulumu, hücre içi kayıt kurulumuna kıyasla hücre dışı yanıtların izlenmesinden biraz farklıdır. Eşlik eden makalede belirtilen ekipmanı kullanarak, yüzeysel fleksör kası innerve eden üçüncü yolu vakum elektroduna çekin.

Artık aksiyon potansiyellerini kaydetmeye başlayabilirsiniz. Bu yolak beş eksitatör motor nöron ve bir inhibitör motor nöron içerir. Bazal aktiviteyi kaydettikten sonra, üretilen aksiyon potansiyellerindeki değişikliği gözlemlemek için kütikülü bir fırça ile uyarın.

Bunun ardından, önceki deneyde olduğu gibi banyo solüsyonunu serotonin gibi nöromodülatörlerle değiştirin ve yanıttaki herhangi bir değişikliği kaydedin. Ek egzersizler beraberindeki metinde verilmiştir. Bu kayıt, kütikülün bir fırça ile uyarılmasından önce ve uyarılma sırasında üçüncü yoldan kaydedilen aksiyon potansiyellerini göstermektedir; fırçalama öncesindeki aksiyon potansiyeli frekansını, uyarılma sırasındaki frekansıyla karşılaştırın.

Bu kayıt, normal salin ve serotonin çözeltisinde üçüncü yoldan kaydedilen aksiyon potansiyellerini göstermektedir. Normal salindeki aksiyon potansiyeli frekansını, az önce gösterilen serotonin içindeki frekansıyla karşılaştırın. Fırçalama, bazal seviyeye göre ateşleme frekansını artırır.

Ayrıca, serotoninin normal saline göre ateşleme frekansını artırdığı gösterilmiştir. Bu şekil, fırçalama ve serotonin birlikte uygulandığında ateşleme frekansında daha da büyük bir artış olduğunu göstermektedir. Dış potasyum konsantrasyonunun dinlenme membran potansiyeli üzerindeki dışsal ve teorik olarak türetilen etkilerinin karşılaştırılması, iyonların membran potansiyeli üzerindeki etkisini ortaya koymaktadır.

Ayrıca hem fazik hem de tonik kasların nöromüsküler kavşaklarında nikotinik yanıtların nasıl kaydedileceğini gösterdik. Bu teknikler, temel kavramları ve fizyolojiyi öğretmek amacıyla araştırma odaklı öğrenci laboratuvarlarında kullanılabilir. Bu laboratuvar uygulamasında elde edilen teknikler, diğer laboratuvar preparatlarıyla ilgili soruların yanı sıra tıp ve sağlıkla ilgili fizyolojik uygulamalarla ilgili soruların yanıtlanması için de kullanılabilir.