Kerevit Hindgut Fizyolojik Deney: Öğrenci Laboratuvar Egzersiz

Bu raporun genel amacı, fizyolojik deneylere katılan ileri düzey lise ve lisans düzeyi fizyoloji dersi öğrencilerinin kullanımı için bir öğretim aracı olmaktır. Öğrenciler, kerevit arka bağırsağındaki kasılmaları açığa çıkarmayı ve kaydetmeyi öğrenirler. Bir sonraki adım, bileşiklerin doğrudan uygulanmasına olanak tanıyan arka bağırsağın hayvandan çıkarılmasıdır.

Ardından, kasılma gücünü değiştiren mekanizmaları incelemek için çeşitli farmakolojik ajanlar uygulanırken arka bağırsak düz kas kasılmalarının kuvveti ve ritmi izlenir. Farmakolojik analizler ve reseptör alt tiplendirmesine dayanarak, modülatörlerin nöral girdiler üzerindeki veya doğrudan kas üzerindeki etkisini gösteren sonuçlar elde edilir. Merhaba, ben Brock Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'nden Dr. J Mercier.

Visseral kasları kontrol eden nörotransmitterler üzerine araştırmalar yapmak için kerevit arka bağırsağını bir preparat olarak kullanmaktayım. Ayrıca bu preparatı bir öğretim aracı olarak da kullanıyorum ve Kentucky Üniversitesi'ndeki Dr. Robin Cooper'ın laboratuvarı ile yaptığımız bir iş birliği kapsamında, eğitim amaçlı öğrenciler tarafından yürütülen bir dizi deneyi mükemmelleştiriyoruz. Bu yöntem, kerevit arka bağırsağının işlevi hakkında bilgi sağlayabilir.

Ayrıca, peristaltik ritimlerin dahil olduğu hastalıklar gibi hastalık çalışmalarında da uygulanabilir. Kas ve nöral innervasyonun modülasyonunun altında yatan mekanizmaları tanımlamak için de kullanılabilir. Öğrenciler; farmakolojik ajanlar, nörotransmitterler ve nörohormonlar aracılığıyla fizyolojik ve farmakolojik verileri yorumlamayı öğrenecek ve reseptör fonksiyonu hakkında genel bir anlayış kazanacaklardır.

Agonistler ve antagonistlerle ilgili olarak öğrenciler, doz-yanıt eğrileri oluşturacak ve verileri istatistiksel analiz için grafik formunda sunacaklardır. Hayvanı anestezi altına almak için, vücut uzunluğu 6 ila 10 cm olan bir kereviti 5 ila 10 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Anestezize edilmiş kereviti bir elinizle kıskaçların arkasından tutun. Her iki taraftan göz çukurundan başın ortasına kadar hızlıca kesin ve ardından kereviti başsız hale getirin.

Hazırlıktan gelen kan kuruduğunda yapışkan hale gelecektir, bu nedenle işlem tamamlandığında aletleri yıkayın. Ardından, bacakları ve kıskaçları kesin. Daha sonra sol ve sağ kuyruk yüzgeçlerini kesin; orta kuyruk yüzgecini ise son segmente ulaşana kadar karnın dorsal tarafı boyunca keserek bırakın.

Ardından son segment boyunca ve diğer yan boyunca kesin. Dorsal kabuğu çıkarın. Diseke edilen kereviti sigara kağıdı ile kaplanmış Petri kabına yerleştirin.

Kötü durumdaki kerevit salini. Hazırlığı sabitlemek için diseksiyon iğnelerini kullanarak örneği Petri kabına sabitleyin. Arka bağırsak genellikle bir kan damarı ve bağ dokusu kitlesi ile çevrilidir.

Bunları pens ile uzaklaştırın. Bağırsaklara zarar vermemeye dikkat edin. Arka bağırsak artık karın boyunca görünür durumdadır.

Diseke edilmiş kerevit preparatının, diseksiyon ve salin maruziyeti şokundan kurtulabilmesi için salin çözeltisi içinde yaklaşık 10 dakika bekletilmesine izin verin. Arka bağırsağın yavaş peristaltik kasılmalarını gözlemleyin. Başlangıç olarak, kasılma hızı artık hesaplanabilir.

30 saniyede meydana gelen kontraksiyon sayısını sayın ve bir kayıt defterine kaydedin. Ayrıca meydana gelen kontraksiyonların tipini ve peristaltik mi yoksa spastik mi olduklarını kaydedin. Herhangi bir peristaltik dalganın yönünü not edin.

Anüs yakınındaki ve karnın orta kısmındaki kasılma hızlarını sayın ve bu iki bölge arasında hız farkları olup olmadığını kontrol edin. Çeşitli test çözeltilerini hazır bulundurun ve bu çözeltilerin banyo salini ile aynı sıcaklıkta olduğundan emin olun. Burada test edilecek ilk çözelti, kerevit salini içerisinde hazırlanmış bir mikromolar serotonin olacaktır.

Bir pipet kullanarak, crayfish'in açıkta kalan abdomen boşluğundaki salini uzaklaştırın ve 1 µM serotonin çözeltisini doğrudan arka bağırsağa uygulayın. Yeni çözeltiyi ekledikten hemen sonra 30 saniye bekleyin ve ardından anüs yakınındaki bölgedeki 30 saniyelik kasılmaları sayın; daha sonra abdomenin orta kısmındaki sonraki 30 saniyelik kasılmaları sayın. Bu sayıları bir tabloya kaydedin ve meydana gelen kasılma türlerini de not edin. Sonraki.

Test çözeltisini kayıt kabından boşaltın ve arka bağırsağı normal kerevit salini ile birkaç kez durulayın. Ardından, preparatı beş dakika boyunca her 30 saniyede bir durulayın. Bu noktada, bu gösterimde bir Mikromolar Topamin olan bir sonraki test çözeltisini ekleyebilirsiniz.

Gözlemlerinizi daha önce yaptığınız gibi kaydedin ve bu işlemi geri kalan test bileşikleri için tekrarlayın. Aynı maddenin birden fazla konsantrasyonunu kullandığınızda, en düşük konsantrasyonla başladığınızdan ve daha yüksek konsantrasyonlara doğru ilerlediğinizden emin olun. Gastrointestinal (GI) kasılma kuvvetini ölçmek için kullanılan düzenek; lab chart seven yazılımı yüklü bir dizüstü bilgisayar, bridge pod, power lab 26 T ve kuvvet dönüştürücüsünü içerir.

Gİ kas kasılmalarının kuvvetini ölçebilmeniz için öncelikle Gİ kanalını izole etmeniz gerekir. Bunu başarmak için son abdominal segmentteki kasları kesin, anüsün her iki yanındaki yumuşak ventral kütikülden iki veya daha fazla iğne geçirin, ardından arka bağırsağı ve anüsü küçük bir kütikül parçasına bağlı bırakarak karın bölgesinin geri kalanını kesin. Bağırsak, toraks ile abdomen birleşim noktasına yakın bir yerden kesilmelidir.

Şimdi GI kanalını, alt kısmı sard ile kaplanmış sığ bir kaba taşıyın. GI kanalının dorsal boyunca uzanan bir kan damarı bulunmaktadır. Bu damarı GI kanalından dikkatlice ayırın.

Hazırlığın üzerine taze kerevit salini dökün. Kuvvet transduserini hazırlığın üzerine getirin. Kuvvet transduserinin altına yapıştırılmış olan pine yakından bakın.

Bağırsağa tutturulan uç küçük bir kıvrıma sahiptir. İğnenin küçük kıvrımını arka bağırsağın kesik ucuna geçirin. Arka bağırsağı tutturduktan sonra, arka bağırsak gergin hale gelene kadar kabı hafifçe hareket ettirin.

Bağırsak gergin ancak aşırı sıkı olmaması gerektiği için bu adımda dikkatli olun. Aşırı sıkılık kasın zarar görmesine neden olabilir. Kap optimal konuma getirildiğinde, kabı sabit tutmak için balmumu veya kil kullanın.

Ardından, yazılımı başlatın. Kayda başlamak için lab chart yazılımını açın. Lab chart karşılama merkezini kapatın.

Sol üst köşedeki kurulum (setup) bölümüne gidin. Sol alt köşedeki kanal ayarları (channel settings) seçeneğine tıklayın. Kanal ayarlarını yalnızca tek bir kanal olacak şekilde değiştirin.

Ekranın sağ tarafındaki tamam butonuna tıklayın. Birinci kanaldaki açık köprü poduna gidin. Menzili, bu durumda grafik tablosunun sağ üst köşesinde bulunan en hassas ayar olan 200 microvolts değerine ayarlayın.

Saniye başına döngü sayısını 2K olarak ayarlayın. Artık kayıt yapmaya hazırsınız. Kurulumun doğru çalıştığından emin olmak için başlat'a tıklayın.

Transduser ucuna bir pipetle hafifçe dokunun. Yazılım tarafından kaydedilen kuvvette bir değişiklik görmelisiniz. Yazılımdaki durdur (stop) düğmesine tıklayın, ardından başlat (start) düğmesine tıklayın ve programın çalışmasına izin verin.

Yaklaşık 20 saniye boyunca, durdur düğmesine tıklayın ve saline etiketli bir yorum ekleyin. Kasılma hızını yalnızca bir sapmanın başlangıcından bir sonrakinin başlangıcına kadar geçen süreyi ölçerek veya bir iki dakika boyunca toplam sapma sayısını sayarak hesaplayın. Hızı, kasılmaların gerçekleşme sıklığına bağlı olarak dakika başına kasılma sayısı veya saniye başına kasılma sayısı olarak hesaplayın.

Kasılmaların kuvvetini ölçmek için, kaydedilen dosyadaki farklı koşullar altındaki kasılmaları karşılaştırmak amacıyla göreceli bir ölçüm kullanın. M işaretçisini temel çizgiye taşıyın, ardından imleci sapmanın tepe noktasına getirin ve ekranın sağ üst köşesinde listelenen değeri not edin. Bu, M noktası ile tepe noktası arasındaki farkı belirten bir delta değeridir.

Değişimi ölçmek için imlecin tepede sabit tutulması gerektiğini unutmayın. Ardından, M işaretçisini ve imleci ilgilenilen bir sonraki dalga formuna taşıyın ve modülatörlerin etkisini incelemek için ölçümü tekrarlayın. Bu hazırlık üzerinde, salini yavaşça bir test çözeltisiyle değiştirin.

Bu durumda, son test olarak bir mikromolar serotonin ekleyin ve kasılma hızını ve kuvvetini kaydetmeye devam edin. Bu preparasyonda, gap junction inhibitörlerinin kasılma hızını veya kuvvetini değiştirip değiştirmediğini test edin; gap junction inhibitörleri arasında bir hep etanol veya karbondioksit ile havalandırılmış salin bulunur. Uzun süreli maruziyet sonrası kas liflerine zarar verebilecekleri için bu bileşikler en son kullanılır; çeşitli bileşiklerin etkisini karşılaştırmak için verileri bir grafiğe aktarın.

Bu preparatın bir diğer ilginç kullanımı, dairesel kaslar tarafından üretilen kuvvetin kaydedilmesidir. Ancak, preparatınıza gap junction inhibitörleri uyguladıysanız, inhibitörler dairesel kaslara zarar vermiş olabilir; bu durumda dairesel kasları test etmek için taze bir arka bağırsak preparatı kullanmalısınız. Dairesel kasları açığa çıkarmak için, bağırsak tüpünü ince bir makasla boylamsal düzlemde kesin.

Hazırlığı kabın bir yanından ince iğnelerle güvenli bir şekilde sabitleyin. Transdüser üzerindeki kancalı iğneyi şeridin diğer ucuna takın. Hazırlığı, longitudinal kaslarda test edilen bileşiklerle aynı bileşiklere maruz bırakın; test edilen bileşikler ile kasılmaların sayısı ve türü arasındaki ilişki burada gösterilmiştir.

Salin, serotonin ve glutamat çözeltileri için kasılma sayısının zamana karşı grafiğini çizebilirsiniz. Salin, serotonin ve glutamat çözeltileri için kasılma sayısının, milivolt cinsinden kasılma kuvvetine karşı grafiğini çizebilirsiniz. Bağırsaktaki farklı bölgelerde bulunan longitudinal ve sirküler kasların çeşitli modülatörlere farklı tepkiler verip vermediğini test etmek için bu grafikler hem longitudinal hem de sirküler kaslar için oluşturulabilir.

Yukarıdaki deneyler, anüsten başlayarak karın boyunca yukarıya doğru farklı bölgelerde tekrarlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, cımbızla gastrointestinal (GI) kanala zarar vermemeye ve kuvvet transduseri ile çok güçlü çekmemeye dikkat etmek önemlidir. Bu prosedürü takiben, iyon kanalı fonksiyonları ve modülasyonları gibi diğer konuları ele almak için kasın elektrofizyolojik kayıtları gibi diğer yöntemler uygulanabilir ve bunlar diğer hayvan modellerindeki diğer dokular için bir model teşkil edebilir.