Western Blot: Numune Hazırlama Algılama

Bu prosedürün genel amacı, uygun ürünler kullanıldığında Western blot işleminin ne kadar kolay gerçekleştirilebileceğini göstermektir. Numune hazırlığının ardından proteinler boyutlarına göre ayrılır ve ardından katı bir faz üzerine aktarılır. Daha sonra proteinler antikorlarla sorgulanır ve tespit edilir; uygun protokollerin ve yüksek kaliteli, maliyet etkin reaktiflerin kullanımı, geliştirilmiş western blotting sonuçları sağlar.

Merhaba, ben San Diego, Kaliforniya'daki EMD Chemicals'da Ar-Ge bilimcisiyim. EMD, Darmstadt, Almanya'daki Merck, KGAA'nın bir iştirakidir. Bugün size bir western blotting prosedürünü göstereceğiz.

Hadi başlayalım. Western blotting işleminin ilk adımı örnek hazırlamadır. Hücreleri, 2.500 ×g'de beş dakika gibi düşük hızlı santrifüjasyonla çöktürerek örnek hazırlamaya başlayın.

Santrifüj işleminin ardından hücre peletlerini süzün. Hücreleri, 10⁶ hücre başına 150 µL olacak şekilde cyto buster protein ekstraksiyon reaktifi içinde iyice resüspande edin. Örneği oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Ardından, santrifüj işlemini takiben numuneyi dört santigrat derecede, 16,000 ×g hızında beş dakika boyunca döndürün. Berraklaşmış SNA'yı yeni bir tüpe aktarın ve analiz aşamasına geçin. Numunenin protein konsantrasyonu değerlendirildikten sonra, proteini denatüre etmek için numuneyi jele yükleme aşamasına hazırlayın.

Sodyum dodiçil sülfat veya SDS gibi iyonik bir denatüre edici deterjan içeren bir örnek tamponu kullanın. Karışımı 95 ile 100 °C arasında beş dakika boyunca kaynatın. Ticari olarak temin edilebilen ön dökümlü bir jel kullanarak proteinler, moleküler ağırlıklarına göre hızlıca ayrıştırılabilir.

Elektroforez ünitesini, Omni PU kimyasal serisi üzerinden sunulan reaktiflerle hazırlanabilecek olan yürütme tamponu ile doldurun. Kuyucuğun ilk şeridine izleme karışımı protein markeri yükleyin. Bu marker, elektroforez sırasında izlemeye olanak tanıyan üç referans banda sahiptir.

Jel boyandıktan sonra, 10 ile 225 kilo Daltons arasında değişen 10 bant görülür. Denatüre edilmiş örneği kalan kuyucuklara yükleyin. Jeli 220 voltunda bir saat boyunca çalıştırın.

Proteinler ayrıştıktan sonra, proteinlerin düzgün ve tekdüze şekilde göç ettiğinden emin olmak için jeli, kullanıma hazır ve DS içermeyen hızlı boyama ve ultrasensitif boyama yöntemiyle Coomassie Blue ile boyayın. Elektrik yüklü proteinlerin bir elektrik alanı içinde jel boyunca hareket etmesi sağlanabildiği gibi, proteinlerin jellerden nitrocelluloz veya PVDF gibi bir membrana elektrik alanı aracılığıyla aktarılabilmesi için boyama işlemi gereklidir. PVDF membran kullanırken, membranı birkaç dakika metanol içinde bekletin ve ardından beş dakika boyunca buz gibi soğuk transfer tamponunda dengeleyin. Ayrıca jeli de birkaç dakika buz gibi soğuk transfer tamponunda bekletin; dengeleme işlemi, transfer sırasında jelin büzülmesini önler.

Islak transfer için, jel ve membrandan oluşan yapıyı sünger ve kağıt arasında sandviç şeklinde düzenleyin. Ardından, jel ile membran arasında hava kabarcığı oluşmadığından emin olduktan sonra düzeneği sıkıca kenetleyin. Sandviç yapıyı transfer tamponuna daldırın ve elektrik alan uygulayın.

Negatif yüklü proteinler pozitif yüklü elektroda doğru hareket edecektir. Membran daha sonra onları durdurur, bağlar ve ilerlemelerini engeller. Transfer tamamlandığında, hava boşluğu olmadan eşit bir transfer gerçekleştiğinden emin olmak için proteinleri görselleştirin.

Bu işlem, red alert Western blot boyası ile kolayca gerçekleştirilebilir. Bu boya kullanıma hazırdır ve boyanın giderilmesi su ile kolayca yapılabilir. Bu, membran antikor ile kanıtlanmadan önce suyla yıkanarak boyası giderilmiş jeldir; ardından membran bloke edilir.

Özgül olmayan bağlanmayı önlemek için membranı yüksek kaliteli bloklama reaktifleri ile bloklayın. Arka plan gürültüsünün artmasını önlemek için membranı bloklama çözeltisi içinde oda sıcaklığında, hafif ajitasyon altında bir saat boyunca inkübe edin ve ardından membranı üç kez TBST veya PBST ile yıkayın. Bu tamponlar, sırasıyla TBS tween tabletleri ve PBS tween tabletleri kullanılarak kolayca ve uygun bir şekilde hazırlanabilir.

Membran bloke edilip yıkandıktan sonra, primer antikor ile inkübe edilebilir. Sinyalin önemli ölçüde artırılmasını sağlayan sinyal güçlendiricilerden biri olan solüsyon birini kullanarak primer antikoru uygulayın. Primer antikoru solüsyon bir içerisinde hazırlayın ve membranı bir saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyon sonrası daha fazla bloklama ajanı eklemeye gerek yoktur. Membranı TBST ile yıkayın. Ardından, membranı signal boost'un ikinci çözeltisiyle seyreltilmiş sekonder antikor ile bir saat boyunca inkübe edin.

Son olarak, HRP konjuge işlemi için membranı tekrar birkaç kez TBST ile yıkayın. Burada geleneksel olarak, geliştirilmiş kemilüminesans veya ECL ile sekonder antikor tespiti kullanılır. Lüminol veya geliştirici karıştırmayı gerektirmediği için ECL reaktifinin hızlı adımı kullanılır.

Membrana birkaç kez püskürtme yapın, iki dakika inkübe edin ve x-ışını filmi kullanarak görüntüleyin. Rapid Step, düşük pikogram duyarlılığın yanı sıra substrat eklendikten sonra iki saate kadar daha hafif bir görev sunar. Trail mix protein markerları, standart Western blot protokolleri ile karşılaştırıldığında elektroforez sırasında protein takibine olanak tanır.

Sinyal Güçlendirici, daha geniş bir dinamik aralık ve hassasiyet sağlar. Son olarak, geleneksel ECL reaktifleri yerine Rapid basamağı kullanılarak üstün hassasiyet elde edilebilir. Kapsamlı bir ürün yelpazesiyle Western körlemesini nasıl verimli ve maliyet etkin bir şekilde gerçekleştirebileceğinizi göstermiş olduk.

Sonuçlarınızın kalitesinin, kullandığınız reaktiflerin kalitesine bağlı olduğunu unutmayın. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.