Immüno Analizi

Genellikle Western blotting olarak adlandırılan immünoblotlama, bir protein örneği içerisinde poliklonal veya monoklonal antikorlar tarafından tanınan spesifik antijenlerin tanımlanması için kullanılır. Bu prosedür tipik olarak tek veya iki boyutlu jel elektroforezini takip eder ve ayrıştırılmış proteinlerin nitroselüloz membranlara transferini içerir. Bu membranların, enzimlerle doğrudan veya dolaylı olarak konjüge edilmiş primer ve sekonder antikorlarla inkübe edilmesi ve protein antijenlerinin renkli veya floresan substrat reaksiyonları kullanılarak bu membranlar üzerinde görselleştirilmesi sürecidir.

Bu videoda, bir immünoblotlama prosedürünün adım adım gösterimini sunuyoruz. Merhaba, ben UVPI'dan Sean Gallagher; buradaki KE Graduate Institute proteomik merkeziyle iş birliği yapıyorum. Bugün sizlere immünoblotlama analizini göstereceğim.

Bu süreç; protein ayırma, proteinlerin membranlara aktarılması, immün problama ve kromojenik ile kemilüminesans substratlar kullanılarak görselleştirme dahil olmak üzere bir dizi adım içerir. Öyleyse başlayalım. İmmün blotting prosedürüne başlamadan önce, protein örnekleri öncelikle küçük veya standart boyutlu tek veya iki boyutlu jeller kullanılarak elektroforez ile ayrılmalıdır.

Antijenik örnekleri hazırlayın ve geldeki hatlara yükleyin; bir veya daha fazla gel hattına önceden boyanmış veya biyotinize protein, moleküler ağırlık standartları ekleyin. Bu protein belirteçleri membrana aktarılacak ve immün boyama sonrası membran yönelimini ve protein boyutlarını kolayca belirtecektir. Elektroforez tamamlandığında, immün blotu oluşturmaya hazırız.

İmmünoblotu hazırlamak için önce jel sandviçini sökün ve yığma jelini çıkarın; jeli oda sıcaklığında transfer tamponu içerisinde 30 dakika boyunca dengeleyin. Bu dengeleme işlemi, transfer sırasında jelin boyutunun değişmesini önlemek için gereklidir. Jel dengelenirken, plastik transfer kasetini içine alacak büyüklükte bir tepsiyi transfer tamponuyla kaseti örtecek şekilde doldurarak transfer sandviçinin kurulumuna başlayın. Şimdi plastik transfer kasetinin alt yarısına bir scotch bright ped veya sünger yerleştirin.

Ardından, jel ile aynı boyutta kesilmiş bir filtre kağıdı parçası alın. Transfer tamponu ile önceden ıslatın ve scotch bright pedin üzerine yerleştirin. 30 dakikalık jel dengeleme işlemi tamamlandığında, jeli filtre kağıdının üzerine yerleştirin.

Bir deney tüpünü veya cam çubuğu jel yüzeyi üzerinde hafifçe yuvarlayarak jel ile filtre kağıdı arasındaki hava kabarcıklarını giderin. Alternatif olarak, BioRad kiti ile birlikte gelen BioRad silindirini kullanabilirsiniz. Filtre kağıtlarını, jelleri ve membranları manipüle ederken eldiven kullanmayı unutmayın.

Ellerinizdeki yağ transferi engelleyecektir. Ardından, transfer membranını hazırlayın. Membranı, jelin boyutundan her kenarda bir ila iki milimetre daha büyük olacak şekilde kesin.

Ardından, membranı bir kenarı 45 derecelik açı yapacak şekilde yavaşça distile suyun içine yerleştirin; su membranın içine kılcallıkla yükselecek ve zamanla tüm yüzeyi ıslatacaktır. Suya çok hızlı yerleştirilirse hava hapsolur ve membran üzerinde beyaz lekeler şeklinde görünür. Protein bu bölgelere transfer olmayacaktır.

Membran tamamen ıslandığında, 10 ila 15 dakika boyunca dengeleme ve transfer tamponuyla bekletin. Bu ıslatma prosedürü nitroselüloz ve naylon membranlar için uygundur. Sadece PVDF membranlar hidrofobiktir ve sadece distile su veya transfer tamponuna yerleştirilerek ıslanmazlar.

PVDF membranlar önce bir ila iki saniye boyunca %100 metanol içine daldırılmalı, ardından transfer tamponunda 10 ila 15 dakika boyunca dengelenmelidir. Membranın herhangi bir zamanda kurumasına izin vermeyiniz.

Bu durum gerçekleşirse, önce metanol ile ve ardından transfer tamponu ile tekrar ıslatın. Membran hazır olduğunda, önceden ıslatılmış membranı doğrudan jelin üst kısmına yerleştirin. Membran yüzeyinde bir deney tüpü cam çubuğunu veya BioRad silindiri nazikçe gezdirerek jel ile membran arasındaki tüm hava kabarcıklarını gidermeyi unutmayın.

Ardından, başka bir parça 3 mm Whatman filtre kağıdını ıslatın. Sonra bunu membranın üzerine yerleştirin ve tekrar tüm hava kabarcıklarını giderin. Daha sonra, bu filtre kağıdının üzerine başka bir Scotch-Brite ped veya sünger yerleştirin.

Transfer kasetinin üst yarısını yerine kilitleyerek immünoblot sandviç düzeneğini tamamlayın. İmmünoblot sandviçi oluşturulduğuna göre, proteinleri jelden membrana transfer etmeye hazırız. Transfer prosedürüne başlamak için elektro-blotting tankını transfer tamponuyla doldurun ve sandviç düzeneğini içeren transfer kasetini elektro-blotting cihazına yerleştirin.

Sandviçin, membranın anot tarafına veya tankın pozitif yüklü tarafına bakacak şekilde yerleştirilmesi önemlidir. Güç kaynağının uçlarını, elektrotransfer aparatının ilgili anot ve katot taraflarına bağlayın. Bu spesifik kriter blot cihazı, bir soğutucu buz bloğu ile birlikte gelir.

Şimdi, proteinlerin jelden membrana elektroforetik transferini, soğutma ile 50 voltta 30 ila 60 dakika boyunca veya soğuk odada 14 voltta gece boyunca gerçekleştirin. Transfer tamamlandığında, güç kaynağını kapatın ve düzeneği sökün. Ardından membranı blotting düzeneğinden çıkarın ve bir köşesini keserek yönünü belirleyin.

Bu noktada membranlar kurutulabilir ve yeniden kapatılabilir plastik bir torba içinde dört derece Celsius'ta bir yıl boyunca saklanabilir. Daha ileri işlemlerden önce, kurutulmuş PVDF membranlar, membranı ıslatmak için az miktarda %100metanol içine yerleştirilmelidir. Ardından, metanolü uzaklaştırmak için distile su içerisine konulmalıdır.

Yönlendirme işaretlendikten sonra, transfer verimliliğini doğrulamak için jeli boyayın. Transfer edilen proteinleri görüntülemek için membranı cipro ruby ile geri dönüşlü olarak veya kamasi blue India ink, naphthol blue veya kolloidal altın ile geri dönüşsüz olarak boyayabilirsiniz. Bu geri dönüşsüz boyama prosedürleri naylon membranlar ile uyumlu değildir.

Proteinler membrana aktarıldığına göre, immün prob ve proteinlerin görsel tespiti aşamasına geçin. Bu adımda, membrandaki immobilize proteinler, mevcut antijenleri tanımlamak ve miktarını belirlemek için spesifik antikorlarla taranır. Başlamak için membranı, 20 milliliters bloklama tamponu içeren plastik bir inkübasyon tepsisine yerleştirin.

Bazı kişiler torba kullanır, ancak farklı primer antikor çözeltilerinde çok sayıda şeridin işlendiği durumlarda özellikle kullanışlı oldukları için genellikle tepsiler tercih edilir. Ardından, mühürlenmiş membranı oda sıcaklığında, bir orbital sarsıcı veya sallama platformu üzerinde ajitasyonla 30 ila 60 dakika boyunca inkübe edin. Membran inkübe olurken primer antikoru ve bloklama tamponunu seyreltin.

Dilüsyon ampirik olarak belirlenir, ancak tipik olarak 1:100 ile 1:1000 arasındadır. Poliklonal antikorlar için; hibrit süpernatanlarda 1:10 ile 1:100 arasında, monoklonal antikorlar içeren murin asit sıvılarında ise 1:1000'den daha yüksek dilüsyonlar kullanılır. İnkübasyon tamamlandığında, bloklama tamponunu dökün.

Tampon çözeltiyi seyreltilmiş primer antikor ile değiştirin ve sabit ajitasyon altında, oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika boyunca tekrar inkübe edin. Ardından, NITROCELLULOSE veya PVDF filtreler için 100 mililitre TTBS veya naylon filtreler için TBS ile ajite ederek membranı dört kez yıkayın.

Membran yıkanırken her seferinde 10 ila 15 dakika boyunca yıkayın, sekonder antikoru bloklama tamponunda seyreltin. Sekonder antikor örnekleri arasında horseradish peroksidaz veya alkalin fosfataz, anti IG konjugatı ve ticari olarak mevcut enzim konjugatları yer alır. Sekonder antikorlar genellikle kullanımdan önce 1/200 ile 1/25.000 oranında seyreltilir.

Yıkama adımları tamamlanıp yıkama materyalleri atıldıktan sonra, seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz veya alkalin fosfataz, anti IG konjuge ekleyin ve oda sıcaklığında, sabit ajitasyon altında 30 ila 60 dakika inkübe edin. 30 ila 60 dakika sonra, membranı kaptan çıkarın ve daha önce açıklandığı şekilde TTBS içerisinde, her biri 10 ila 15 dakika sürecek şekilde dört kez yıkayın.

Yıkama işlemleri tamamlandığında, görselleştirme adımına geçmeye hazırız. Ancak öncelikle, alternatif bir immün problama prosedürünü göstereceğiz. Bu alternatif immün problama prosedürü, Vector Labs'in Vector Stain ABC kitine dayanmaktadır.

Biyotillenmiş sekonder antikora horseradish peroksidaz (HRP) veya alkalin fosfataz (AP) bağlamak için bir avidin-biotin kompleksi kullanılır. Bugün HRP kitini uygulamalı olarak göstereceğiz. TTBS, avidin-biotin sistemleri için bloklama tamponu olarak oldukça uygundur.

Ancak naylon filtreler için, yağsız süt tozunun immünanalizi engelleyecek kalıntı biyotin içermesi nedeniyle protein bağlayıcı reaktifler önerilir. Sadece bloklama adımında kullanılmalı; membran, orbital bir çalkalayıcı veya sallanır platform kullanılarak sürekli ajitasyon altında, açık bir tepside bloklama tamponu ile dengeye getirilmeye başlanmalıdır. Membran dengeye gelirken, oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika boyunca inkübe edin.

Birincil antikor çözeltisini hazırlayın. Yüksek hassasiyetli Adenin Biotin sistemli NITROCELLULOSE veya PVDF membranlar için TTBS kullanın.

Primer antikor içeren serumun dilüsyonları genellikle 1/1000 ile 1/100.000 arasında değişir. Kemilüminesans kimyasının kullanımı, dilüsyonların daha yüksek aralıklarda olmasını gerektirir. Bizim durumumuzda, kromojenik yöntem gösterilmektedir.

Birincil antikoru 5.000'de 1 oranında dilüsyonla kullanıyoruz. Dengeleme işlemi tamamlandıktan sonra bloklama tamponunu uzaklaştırın. Ardından, membranı kaplayacak miktarda birincil antikor solüsyonu ekleyin.

Membranı oda sıcaklığında, hafifçe sallayarak 30 dakika boyunca inkübe edin. Nitrocellulose membranı, beşer dakikalık aralıklarla üç kez TTBS ile yıkayın. Yıkama aşaması sırasında, bir damla biyotinize antikoru 10 mililitre TTBS ile seyrelterek biyotinize sekonder antikor çözeltisini hazırlayın. Yıkama adımları tamamlandığında, sekonder antikor çözeltisini ekleyin.

Membran, sekonder antikor ile inkübe edilirken oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yavaşça sallanarak inkübe edin. Bunun için avadon biotin HRPO'yu hazırlayın. 10 mililitre içerisine iki damla vti boyama reaktifi A ve iki damla reaktif B karıştırın.

Nitroksellüloz için TTBS. Sekonder antikor inkübasyonu tamamlandığında, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Membranı 15 dakikalık bir süre boyunca üç kez TTBS veya TBS ile yıkayın.

Ardından, avidan biotin enzim çözeltisini membrana ekleyin ve oda sıcaklığında, yavaşça sallayarak 30 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra membranı, 10 dakikalık aralıklarla üç kez TTBS ile yıkayın. İmmün prob yöntemi tamamlandığına göre, membrana bağlı proteinler kromojenik substratlar ile görüntülenmeye hazırdır.

Bu son görselleştirme adımı için, horseradish peroksidaz tabanlı immün tespit prosedürlerinde genellikle dört CN dab/ICL 2 ve TMB substratları kullanılır. İmmün prob prosedürü sırasındaki son membran yıkaması TTBS ile yapıldıysa, membranı oda sıcaklığında 50 mL TBS ile 15 dakika boyunca yıkayın. Şimdi membranı kromojenik görselleştirme solüsyonuna yerleştirin.

Protein bantları 10 ila 30 dakika içinde görünmelidir. 30 dakikalık inkübasyonun ardından substrat reaksiyon karışımını atın ve distile su ekleyerek reaksiyonu sonlandırın. İmmünoblotlama, bir veya iki boyutlu elektroforezin ardından spesifik proteinlerin varlığını tespit etmek için binlerce laboratuvar tarafından kullanılan çok aşamalı bir prosedürdür.

Size bir immün kan analizinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş oldum. Hepsi bu kadar. Deneylerinizde başarılar dilerim, izlediğiniz için teşekkürler.