Bir Tümör Mikroçevre yeniden oluşturmak için mikroakışkan Cihazı

Bu prosedürün genel amacı, in vitro ortamda tümör mikroçevrelerini yeniden oluşturan ve kemoterapötik ilaçların test edilmesi için kullanılabilecek bir mikroakışkan cihazın fabrikasyonunu ve çalıştırılmasını göstermektir. Bu, mikroakışkan cihazdır. Bu cihaz, kemoterapötik ilaçların in vitro ortamda kolayca test edilmesi gibi aşağıdaki alanlarda faydalı olabilir.

Üç boyutlu tümör dokusunun test edilmesi için tutarlı ve doğru sonuçlar sağlar ve bu cihaz, in vivo tümörün oldukça doğru bir temsilini sunar. Tümörler 3B mikroçevrelerde bulunur ve bu ortamda test yapabilme yeteneği oldukça önemlidir. Prosedürün ilk adımı; yumuşak litografi kullanılarak mikroakışkan çipin üretilmesini, giriş ve çıkışlara delikler açılmasını, bir cam lam üzerine yapıştırılmasını ve akış girişi ile çıkışı için boruların bağlanmasını içeren cihazın kurulumudur.

Ardından, cihazda kullanılmak üzere asılı damla yöntemi kullanılarak tekdüze çok hücreli tümör sferoidleri oluşturulur. Sferoidler daha sonra cihaza yerleştirilir ve bunu apoptoz, tespit ajanları ve kemoterapötik ilaçlar takip eder. Son olarak, kemoterapötik ajanın penetrasyon yeteneğini nicelleştirmek amacıyla, zaman ayarlı mikroskopi gerçekleştirilir ve ardından ilaç difüzyon katsayılarının matematiksel tahmini yapılır.

Nihayetinde, zaman ayarlı floresan mikroskopisi kullanılarak, cihaz içindeki doku büyümesini, doku içerisinde heterojen mikroortamların oluşumunu ve dokuya ilaç difüzyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Kanser ilaçlarının katı tümörlere sınırlı penetrasyonu, bu ilaçların başarısızlığının önemli bir nedenidir. Mevcut kanser ilacı test modellerinin çoğu, katı tümörlerin üç boyutlu doğasını taklit etmemektedir.

Sürekli perfüze edilen üç boyutlu tümör dokularından oluşan bir mikroakışkan cihaz geliştirdik. Bu model, ilaçların katı tümörlere iletimini ve sistemik klirenslerini daha doğru bir şekilde temsil etmektedir. Çok hücreli tümör sfereoidleri, üç boyutlu tümör dokularının kabul görmüş bir modelidir.

Bu prosedürde, mikroakışkan cihazda kullanılacak steroidleri oluşturmak için asılı damla yöntemi kullanılır. Bu yöntem, kısa bir süre içinde tutarlı steroidlerin oluşmasını sağlar. Kemoterapötik ilaçların üç boyutlu dokularda in vitro olarak test edilmesi, ilaçların hücre tek tabakalarına kıyasla daha verimli bir şekilde taranmasına yardımcı olabilir.

Silikon elastomerdeki PDMS ve kürleme ajanını dokuz bir ağırlık oranında karıştırın. Ardından, dört milimetre kalınlığında bir tabaka oluşturmak için bu karışımı mastarın üzerine dökün. Hava kabarcıklarını gidermek için degaz yapın ve 60 °C'de beş saat boyunca kürleyin.

Elastomer üzerinde akış özelliklerine sahip bir damga elde etmek için kürlenmiş PDMS'yi kalıptan soyun. Ardından, bir matkaba takılmış bir buçuk milimetrelik bir biyopsi punch'ı kullanarak giriş ve çıkışlar için delikler açın. Varsa tüm kalıntıları temizleyin.

Damganın özellik tarafını ve temiz bir cam lamı sekiz dakika boyunca oksijen plazmasına maruz bırakın. Bir oksijen plazma aşındırıcıda, aralarında bir bağ oluşması için işlem görmüş yüzeyleri hemen birbirine temas ettirin. Düzen eki, bir lam ısıtıcı üzerinde en az beş saat boyunca 60 °C'de tutun.

Bağlantıyı güçlendirmek için 0.032 inches ID PTFE tüpleri mikroakışkan cihazın giriş ve çıkışlarına bağlayın. Barblı dişi luer lock konnektörlere takılı erkek luer lock konnektörlerden oluşan bir ara yüz kullanarak, kırılma olmadan kolayca geçiş yapılmasına olanak tanıyan bu özel konnektörler kullanılır. Son olarak, kesme vanaları ve bir Y konnektör kullanarak akış düzeneğini kurun ve cihazı mikroskoba monte edin. Cihazı monte ettikten sonra, akış kurulumunu tamamlamak için tüpleri uygun giriş ve çıkışlara bağlayın.

Bu şekilde gösterildiği üzere, bu konfigürasyon bir sferoidin cihaza yerleştirilmesinde kolaylık ve çok yönlülük sağlar veya yerleştirme işlemini gerçekleştirmek için cihaz üzerinden bir ortam akışı oluşturulmasına imkan tanır. Paketleme giriş valfi VPN'yi ve paketleme çıkış valfi VP out'u açın. Ardından bir tümör sferoidi girişten geçerek kültür odasına akabilir; bu odadaki direk, ortam akışı sırasında tümörü sabit tutacaktır.

Üniform PHE oluşumunu başlatmak için paketleme valflerini kapatın ve akış giriş valfi VF in ile akış çıkış valfi VF out'u açın. Kültür kabininde, asılı damla yöntemini kullanarak tripsin buz hücrelerini hazırlayın. Ortaya çıkan tripsin hücrelerini santrifüjden alın.

Tablo bir'e bakarak stok çözeltiyi istenen konsantrasyona kadar seyreltin. Ardından, 48 kuyucuklu bir plakanın kapağını çıkarın ve plakayı ters çevirerek yerleştirin. Steril bir kabin içerisinde, plakanın her bir kuyucuğunu bir mililitre steril su ile doldurun.

Nemini korumak için, kapağın üzerindeki her dairesel bölgeye 20 µL seyreltilmiş hücre çözeltisi damlası yerleştirin. Bir mikropipet kullanarak kapağı dikkatlice ters çevirin ve damlaların kuyucuk kenarlarına temas etmediğinden emin olarak plak üzerine yerleştirin. Plağı 37 °C'de inkübe edin.

Kullanılan hücreye göre inkübasyon süresi için tablo bire bakınız; her asılı damlada bir steroid oluşacaktır. Akış girişinden %70 etanol geçirerek cihazı sterilize ederek başlayın. Ardından sırasıyla PBS ve H-E-P-E-S tamponlu hücre kültürü besiyeri ile durulama yapın.

Besiyeri şırıngasını bırakın ve tübe bağlayın. Ardından, şırınga musluğuna iki ila üç Steroid çekin. Hava kabarcıklarını gidermek için şırıngayı cihazın paketleme girişine bağlayın.

Giriş valfi VPN'yi açın ve çıkış valfi VP out'u kapatıp VF out'u kapatın. Paketleme şırıngasını, iğne aşağı bakacak şekilde dikey tutun. Steroidin şırınganın altına, iğnenin luer lock konnektörüne çökmesini izleyin.

Paketleme şırıngasının pistonunu itin ve sadece paketleme çıkış valfi açık olduğu için PHE'nin tübe girdiğini ve cihazın içine aktığını gözlemleyin. Bir steroid, cihazın haznesine girecek ve arkadaki destekler tarafından tutulacaktır. Haznenin içine giren S sferoidi, haznenin şeklini alır ve dikdörtgen bir geometri kazanır.

Giriş valfi VPN ve çıkış valfi VP out kapatın, ardından akış şırıngasını SF şırınga pompasına yerleştirin. Bu pompa, Syringe Pump Pro yazılımı kullanılarak bir bilgisayar tarafından çalıştırılır; giriş valfi VFN ve çıkış valfi VF out açın. Cihaza ortam akışını dakikada 3 µL hızında başlatın.

Sferoidlerin 24 saatlik inkübasyonunun ardından apoptoz tespit ajanları eklenir. Apoptoz tespit veya terapötik ajanları eklemeden önce, besin gradyanlarının ve mikroortamların oluşması için sferoidlerin 24 saate kadar dengelenmesine izin verin. Ardından VFN valfini kapatın.

Şırınga pompasını durdurun. Şırıngayı pompadan çıkarın ve yerine mililitrede 0,25 microliters CASP glow red aktif Caspase three markörü içeren besiyerli şırıngayı yerleştirin. Cihazdan manuel olarak 0,7 milliliters solüsyon geçirerek cihazı yıkayın.

Ardından şırıngayı pompaya yerleştirin. Akışı yeniden başlatın ve VFN valfini açın. Beş ile sekiz saatlik bir süre boyunca, cask glove red active cph phase three dokuya difüze olacak ve apoptotik bölgelerde daha parlak floresans verecektir. Bu konsantrasyondaki apoptoz tespit edici ajan, sonraki tüm akış çözeltilerinde sabit tutulur.

Doksorubisin, apoptoz tespit ajanlarının uygulanmasından beş ila sekiz saat sonra uygulanır. Bu işlem, sistemin yıkanmasıyla temizlenir. Kemoterapötik ajanları eklemek için, 10 µM doksorubisin hidroklorür uygulamak amacıyla apoptoz tespit prosedürünü izleyin.

Ardından, tedavi şırıngasını 0,7 mL besiyeri içeren şırınga ile değiştirin. Terapötik ajanın akışını belirli bir süre boyunca devam ettirin. Daha sonra VFN valfini kapatın ve şırınga pompasını kapatın.

Tedavi şırıngasını şırınga pompasından çıkarın ve yerine 0,7 milliliters besiyeri içeren şırıngayı yerleştirin. Dokuyu mikroskop altında sürekli izleyerek taze besiyerinin 24 ila 36 saat boyunca akışına izin verin. Time-lapse mikroskopi için tüm görüntüleme süreci, IP lab'deki özelleştirilmiş bir betik kullanılarak otomatikleştirilmiştir; PAX Foid'in iletim ışığı ve floresan görüntülerini 10 x büyütmede her 30 dakikada bir edinin. İlaç difüzyon katsayılarının matematiksel tahmini için ilk adım, Image J kullanarak doku floresanının ortalama doğrusal yoğunluk profillerini oluşturmaktır. Kamara içindeki dokuyu kapsayan dikdörtgen bir ilgi alanı veya ROI seçin.

Akış kanalından olan uzaklığın bir fonksiyonu olarak ortalama yoğunlukların bir profilini oluşturmak için plot profile komutunu kullanın. İşlemi üç farklı zaman noktasına kadar tekrarlayın. Ardından, elde edilen yoğunluk profillerinden ortalama arka plan floresans yoğunluğunu çıkarın ve X ve T'nin bir fonksiyonu olarak C'yi elde etmek için her bir profili ilgili maksimum yoğunluğu kullanarak normalize edin. Burada C, doksorubisinin normalize edilmiş konsantrasyonudur ve C değeri sıfır ile bir arasında değişir.

Bir sonraki adım, tümör dokusu içindeki doksorubisinin etkili difüzyon katsayısını değerlendirmektir. Difüzyon, ERFC'nin tamamlayıcı hata fonksiyonu olduğu aşağıdaki denklemle temsil edilebilir. X, kanaldan doku içine doğru olan mesafeyi ve T, doksorubisin uygulamasından sonra geçen süreyi ifade eder.

Ele alınan her zaman noktasında aşağıdaki yinelemeli şemayı kullanın. D için bir değer tahmin edin. Her konumda denklemin sağ tarafını hesaplayın. X. İki taraf arasındaki kareler toplamı hatasını hesaplayın, artık ortalamasını minimize etmek için D değerini güncelleyin.

Dokudaki doksorubisin ortalama efektif difüzyon katsayısını tahmin etmek için her bir zaman noktasında elde edilen D'nin optimum değerleri. Mikroakışkan cihazlar, üç boyutlu tümör dokusunun büyümesi için bir milimetre x 0,3 milimetre x 0,15 milimetre boyutlarında optik olarak erişilebilir kültür odacıkları sağlamıştır. Asılı damla yöntemi, çeşitli hücre hatlarından tutarlı boyut ve şekilde tümör PHE'lerinin hızlıca oluşturulmasına olanak tanımıştır.

PHE'ler cihaz üzerinde üç güne kadar başarıyla büyütülmüştür. Kamaralardaki büyüme, mikroortamların tekrarlanabilir modifikasyonu ile ilişkilendirilmiştir. PHE içerisinde, akış kanalına yakın hücrelerde apoptoz daha az gerçekleşmiş, dokunun daha yüksek ve derin kısımlarında ise daha fazla görülmüştür.

Cihaz, doksorubisin ve tümör dokusunun difüzyon katsayısını tahmin etmek için kullanılmıştır. Deneysel olarak elde edilen değer, insan meme kanseri için daha önce rapor edilen değerle uyumluydu. Bu prosedür uygulanırken, hücre kültürü dışında gerçekleştirilmesi gerektiği için PHE cihaza akıtılırken steriliteyi koruma konusunda ekstra dikkatli olunması önemlidir.

Steriliteyi sağlamak için davlumbaz sprey şırıngalarını ve tüp uçlarını bol miktarda etanol ile püskürterek temizleyin. Bu videoyu izledikten sonra, ilaçların tümörlere sınırlı penetrasyonunun rolü hakkında bilgi sahibi olmalısınız. Üç boyutlu tümör dokularında ilaçların iletimini ve sistemik klirensini taklit eden ve bunların penetrasyonunu nicelleştiren bir teknik göstermiş bulunmaktayız.

Kötü nüfuz eden ilaçların elenmesi, kanser ilacı geliştirme sürecini önemli ölçüde kolaylaştıracaktır.