Kaliks Patch Kelepçe Kapasitans Kayıtlar Yöntemleri

Merhaba, benim adım Ken Paradiso. NIH'in Bethesda kampüsünde yer alan Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü İntramural programında Ling Gang Wu ile çalışıyorum. Size kaliks tipi presinaptik kayıt yama kenetleme (patch clamping) tekniklerini göstereceğim.

Beyin dokusunu hazırlamak için, beyni sıçan üzerinden çıkarıyoruz. Beyni, buz gibi soğuk, düşük kalsiyum içeren bu çözeltinin içine yerleştiriyoruz; beyne her an oksijen sağlanması için çözelti karbogen ile kabarcıklandırılmaktadır. Ayrıca, hasar miktarını en aza indirmek için çözeltinin buz gibi soğuk olması gerekmektedir.

Bu durumda beyin şu an bu çözeltinin içinde olacaktır. Beyni dışarı çıkarıp bloğa yerleştirilebilecek şekilde uygunca keseceğiz ve Sano correlate veya hızlı yapıştırıcı ile bloğa monte edeceğiz; ardından hazneyi buz gibi, düşük kalsiyumlu çözelti ile doldurup havalandıracağız, vibratöre yerleştireceğiz ve ardından 70 hertz bıçak frekansında ve 0,01 ila 0,02 mm/s ileri ilerleme hızında, 180 ila 190 mikron kalınlığında dilimler keseceğiz. Bu da saniyede 10 ila 20 mikron olacaktır.

Her bir dilim hazırlandıktan sonra, dilimleri buz gibi soğuk salinden, normal kalsiyum solüsyonu içeren bu hazneye aktarıyoruz. Bu solüsyon, kayıt yaptığımız solüsyonla aynıdır ve 37 derece fizyolojik sıcaklıktadır. Ardından, dilimleri toparlanmaları için buraya yerleştiriyoruz.

Fizyoloji deneyleri gerçekleştirilmeden önce burada yarım saat ile bir saat arasında bekletilir. Şimdi burada beyin var ve onu solüsyondan çıkarıyorum. Demonstrasyon amaçlı olarak burada daha büyük bir beyin kullandım.

Bu, P 20 bir sıçandan alınmıştır. Onu ters çevireceğiz. İlgilendiğimiz kısım beyin sapıdır.

Böylece buradaki bu alan ve kaliks, tam olarak orada olduğu gibi sabitlendi. Şimdi yapacağımız işlem, beynin geri kalan kısmını kesmek, beyin sapını izole etmek ve ardından beyin sapını dilimleme haznesi için hazırlamaktır. Tamam, beyin sapını izole ederek beynin geri kalan kısmını keseceğiz.

Nerede olduğumuzu göstermek için onu ters çevireceğim. Normalde bunu bu şekilde yapmazdık ve tekrar belirtmek gerekirse, bu kısmın tamamını çıkarabiliriz. Tekrar düz çevirdiğimizde, beyin sapını izole etmiş olduk ve tam oradan bir kesi daha yapacağız.

Tamam, bu kadar. Burası beyin sapıdır. Held kaliksi tamly şurada ve şuradadır.

Burası beyin sapıdır. Tekrar, onu biraz geriye iteceğiz. Serebellumun bir yanını keseceğiz ve bu, beyin sapının bu şekilde yan yatmasını sağlayacak.

Bir miktar Sano akrilik yapıştırıcı sürdük ve yan tutmaya devam ederek hızlıca soğuk buz ve soğuk düşük kalsiyumlu solüsyonla doldurduk. Oksijen hattını mümkün olan en kısa sürede yerleştirin. Şimdi ise onu kaldırıp vibratöre götürüyoruz.

Beynin başlangıcına ulaşmak için hızlıca ilerletiyoruz ve ardından beynin başlangıcına vardığımızda hızı 0.01 milimetre/saniye değerine düşürüyoruz. Yani saniyede 10 mikron. Böylece inanılmaz derecede yavaş bir hızla hareket ediyor.

Beynin ilk kısmı, trapezoid gövdenin medial nükleusları olan mtb'yi içeren kısımdır. Ve burası, tamam, transfer pipetine aldıktan sonra, onu pipetin ucuna mümkün olduğunca yakın getirmeye çalışıyorum. Ve işte beyin dilimi; onu, normal kalsiyum seviyelerine ve daha yüksek bir sıcaklığa sahip standart bir kayıt solüsyonu içeren bu hazneye oldukça hızlı bir şekilde aktarıyorum.

Bu işlem, dilimlerin dilimleme prosedürlerinden sonra toparlanmasını sağlayacak ve böylece fizyoloji deneyleri için hazır hale gelecekler. Tamam, buradan sonrası sürekli aynı şekilde devam edecek. Patch clamp işlemini gerçekleştirmek için kullanacağım ekipmanlar şunlardır.

Sabit sahne düzenekli dik bir mikroskobumuz var. Belirttiğim gibi, sahne sabit olduğu için mikroskop bir manipülatör aracılığıyla onun altında hareket eder. Sahneyi tutmak için Wigs ve Newman mikro manipülatörü kullanıyoruz; amplifikatörün kafa katı için ise Hepta marka EPC 10 patch clamp amplifikatörü kullanıyoruz.

Ayrıca belirtmem gereken bir diğer husus, DIC sistemini kızılötesi ışıkla kullandığımızdır. Burada bir IR kamera mevcut, bu nedenle CAE'leri ararken gördüğümüz her şey ekrana yansıyacaktır. Patch clamp amplifikatörü, yine Heca tarafından üretilen Pulse adlı bu yazılımla kontrol edilmektedir; bu yazılım hem amplifikatörü hem de tüm fizyoloji deneyini yönetecektir.

Sonuçlar bu ekranda görünecektir. Tutulan kaliks büyük bir presinaptik terminaldir ve büyük olduğu için terminale fiziksel olarak patch yapmamıza olanak tanır. Böylece presinaptik kayıtlar alabiliriz ve bu, özellikle MSS'de oldukça benzersiz bir durumdur.

Böylece presinaptik olarak aktive olan kalsiyum kanallarını ölçebiliriz. Ayrıca, kalikse giden siniri uyarmak istersek, aksiyon potansiyeli aktivitesini de ölçebiliriz. Bu laboratuvarda yaptığımız işlem, nörotransmitter içeren veziküllerin membranla birleşmesi olan ekzositoz adı verilen süreci ölçmektir.

Şimdi, bu veziküller ekzositoz adı verilen süreçte membranla kaynaşır; böylece sinaptik terminale membran eklemiş olurlar ve biz bunu kapasitanstaki bir değişim olarak ölçebiliriz. Terminale membran eklendiğinde kapasitansta bir artış meydana gelir; dolayısıyla bugün göstereceğim deneyler, membran geri çekildiğinde presinaptik olarak yapılan kapasitans ölçümleridir. Sürekli membran ekleyemezsiniz, haliyle bir kısmını geri çekmeniz gerekir.

Bu işlem endositoz veya membran alımı olarak adlandırılır. Bunu da ölçebiliriz ve bu, kapasitans seviyesindeki bir azalma şeklinde ölçülecektir; bunun örneklerini daha sonra göstereceğiz. Bu yöntem, kalsiyum kanalı aktivitesini izlememize ve ayrıca ekzositoz ile endositozda yer alan bazı proteinleri izleyip incelememize olanak tanır.

Ekzositoz veya endositozda yer alan proteinleri bloke etmek için peptitler gibi maddeler ekleyebiliriz. Aynı işlevi gören toksinler de kullanabiliriz. Ayrıca terminale giren kalsiyum miktarlarını ayarlayabiliriz; böylece ekzositoz sürecini, nörotransmitter salınımını ve bu olayı takip eden membran geri alımını derinlemesine inceleyebiliriz.

Bu, hücre içi kayıt solüsyonumuzu içeren tüptür. Bu solüsyonu önceden hazırlar ve ardından dondururuz; genellikle yeni bir solüsyon hazırlamadan önce birkaç hafta ile bir ay boyunca kullanabiliriz. Kayıtlarımıza başlamadan hemen önce tekrar düşündük, çünkü tüpünüzün içine her zaman belirli miktarda toz partikülü veya başka türde kalıntılar girecektir.

İki yöntemden birini uygulayabilirsiniz. Ya çözeltiyi çıkarıp filtreleyebilir ya da bir veya iki dakika boyunca santrifüjleyip ardından çözeltiyi çekerek, içinde kalıntılar ve diğer maddelerin bulunduğu dip kısmı bırakabilirsiniz. Ben santrifüjlemeyi tercih ediyorum ve şimdi bunu yapacağım.

İşte hücre içi çözeltimizi içeren tüp. Çözeltinin çözünmesi sağlandı. Çözeltideki büyük toz partiküllerini uzaklaştırmak için tüpü küçük bir santrifüjde yaklaşık iki ila üç dakika boyunca döndüreceğiz.

Şimdi, santrifüj ettiğimiz üst faz çözeltisini, çalkalamamaya dikkat ederek temiz bir tüpe aktarıyorum ve bunun yaklaşık %90'ını çekiyorum. Yine en alttaki küçük kısmı almamaya çalışıyorum. Bu yüzden tam burada duracağım.

Deney boyunca güzelce soğuk kalması için bunu hemen buza koyuyorum. Bu çok önemlidir. Bu, kullandığımız pipetlerden biridir.

Bunu hücre içi kayıtlar için kullanıyoruz. Bu, dış çapı iki milimetre ve iç çapı 1,16 milimetre olan, kalın duvarlı silika cam bir pipettir. İlk olarak, pipeti geriye doğru dolduruyoruz.

Ardından vakum uyguluyoruz, pipeti kayıt solüsyonuna daldırıyoruz ve başka türlü dolmayacak olan pipetin en uç kısmını doldurmaya çalışmak için vakum uyguluyoruz. Bunu yaptıktan sonra, bir kapiler tüp alıyoruz ve pipetin arka kısmını kullanarak elektrodun geri kalanını dolduruyoruz. Bu, standart bir fizyoloji tekniğidir ve işlemin özü pipete hafifçe vurmaktır.

Pipet ucunu kırma riskiniz vardır, ancak bunu yapmazsanız genellikle hava kabarcıklarıyla karşılaşırsınız. Tamam, şimdi bunu, patch clamp amplifikatörünün kafa katına bağlı olan pipet tutucumuza yerleştiriyoruz. Orada bir gümüş klorür teli bulunmaktadır.

Gümüş klorür tel hücre içi solüsyonla temas eder ve bu sayede presinaptik terminaldeki elektriksel aktiviteyi ölçebiliriz. Bu nedenle, içinde çok sayıda CAE bulunan kesiti buluruz. Yüksek CAE yoğunluğu istiyoruz.

Şimdi, MNTB olarak adlandırılan trapezoid gövdenin medial nukleusunu arıyoruz; kaliks app'ı oluşturan veya kaliks app'ın bulunduğu yer burasıdır. Bu nedenle, kesit boyunca taramaya başlıyoruz. Örneğin, burada yüzeyin biraz derinliğinde bir kaliks var ancak tutunacak pek bir şey yok, bu yüzden yüzey boyunca taramaya devam ediyoruz.

Burada hedeflediğimiz bir çanak yaprak (calyx) bulunuyor. Pipetin geleceği yeri belirlemek için ekrana iki işaret koydum. Pipet aşağı indiğinde hedef alacağım çanak yaprak parçasını burada görebilirsiniz.

Pozitif basınç uygulayacağım, böylece kalikse doğru yukarı itecek ve ardından pozitif basıncı serbest bırakacağım. Kaliks daha sonra pipete doğru yukarı itilecek ve bu noktada çok hafif bir vakum uygulayarak membranı çekmeye ve itmeye veya membranın pipet ucuna yapışmasını sağlamaya çalışacağım. Tamam, pozitif basıncı serbest bıraktım.

Ve şimdi vakum uygulayacağım. Burada, beş milivoltlık bir pals, ya da aslında dört milivoltlık bir pals uyguluyoruz. Tamam, bu kadar. Tamam.

Şimdi membran potansiyelini -80'e düşürerek hızlı geçici akımı iptal ediyoruz. Şimdi bütün hücre (whole-cell) moduna geçeceğiz. Hafif bir vakum uygulayarak bütün hücre moduna girmeyi deneyeceğim.

Bu şarj geçişleri, pipetin ve hücrenin artık sürekli olduğunu, yani bütünsel bir kayıt alındığını göstermektedir. Bu da başka bir güzel görüntü. Buradaki açık kırmızı renk kapasitans izidir ve burada ani bir sıçrama olduğunu, ardından azaldığını görebilirsiniz.

Tamam, size calyx destekli presinaptik terminalden kayıt alma konusundaki temel teknikleri göstermiş oldum. Medial nucleus of the trapezoid body içeren kesitlerin nasıl hazırlanacağını gösterdim. Calyx destekli yapıları burada bulacaksınız.

Kesitleri inceleme tekniklerini size gösterdim. Yüzeyde en fazla kaliks bulunan kesiti bulmak için her bir kesiti tek tek inceleyeceksiniz. Ardından bulabileceğiniz en büyük kaliks membranını seçip üzerine patch clamp kaydı yapacaksınız.

Ayrıca size patch clamp kayıt tekniklerini gösterdim ve bunlar standart patch clamp kayıt teknikleridir.