Koklear İç Saç Hücreleri Ulaşın Afferent Dendritler postsinaptik Kayıtlar: Şerit Synapse Multivesicular Yayın İzleme

Bu prosedürün genel amacı, iç tüy hücresi aferent sinapslarındaki post-sinaptik aktiviteyi kaydetmektir. Bu işlem, öncelikle başı kesilmiş bir sıçandan yeni çıkarılmış bir kokleanın duyusal epitelinin açığa çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, eksize edilmiş apikal kısmın modifiye bir lamel üzerine yerleştirilmesi ve kayıt haznesine aktarılmasıdır.

Prosedürün üçüncü adımı, kayıt elektroduna sahip bir aferent batonu belirlemek ve ona erişim sağlamaktır. Prosedürün son adımı ise, patch clamp tekniğinin tüm hücre konfigürasyonunu oluşturmak için aferent fiber membranına sıkı bir sızdırmazlık sağlamak ve ardından membranı yırtmaktır. Nihayetinde, tüm hücre patch clamp elektrofizyolojisi aracılığıyla tek bir şerit sinapsından gelen post-sinaptik olaylar veya potansiyelleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Koklear dokunun diseksiyonu ve hazırlanması öğrenilmesi zor olduğundan ve küçük aferent lifleri tanımak ve onlara erişmek güç olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Diseksiyona başlamadan önce, kayıtlar sırasında preparatı yerinde tutacak modifiye edilmiş bir lameli hazırlayın. Sekiz ila 12 milimetrelik dairesel bir cam lamel kullanarak, lamelin kenarına doğru bir damla yarı kürlenmiş syl guard uygulayın.

İnce bir böcek iğnesinin kalın ucunu lamelin üzerine yerleştirin. Böcek iğnesini cama sıkıca bastırın. Pens yardımıyla, sabitlemek için sill koruyucuyu ısıtılmış bir bobine karşı ısıtın.

Eşlik eden metinde açıklandığı şekilde 10 ila 20 mikro elektrot hazırlayın. Mikro forge ile ateşle cilalama işleminden sonra, mikro elektrodun dış uç çapı yaklaşık bir mikron olmalıdır. Üç haftalık bir sıçanın anesteziye alınması ve kafasının kesilmesinin ardından, pipet duvarının nihai kalınlığı yaklaşık bir mikrometre'nin üçte birine eşittir.

Diseksiyona deriyi çıkararak başlayın, baş kısmını diseke edin ve beyni çıkarın. Temporal kemiği açığa çıkarmak için her iki temporal kemiği de çıkarın. Her bir temporal kemiği, standart hücre dışı solüsyon içeren temiz bir diseksiyon kabına yerleştirin. Bir sonraki adım, kokleayı açığa çıkarmak için temporal kemiği çevreleyen kemik kısmını çıkarmaktır.

Temporal kemiği tabanından bir pensle güvenli bir şekilde tutun. Round ve oval pencereleri ve kohleayı tanımlayın. Oval pencere ve kohleanın sarmal tarafı yukarı bakacak şekilde kohleayı yönlendirin.

Kokleanın etrafındaki fazla kemiği temizleyin. Kemiğin geri kalanından daha şeffaf olan bölgeden başlayarak, kemiği doğrudan kokleanın üzerinden yongalamak için ikinci bir ince pens kullanın. Bu bölgede kemik daha ince olduğundan temizlenmesi daha kolaydır.

Apikal kıvrımın etrafındaki kemiği çıkarmaya devam edin. Apikal kıvrımın altındaki modiolusu kesmek için mikro disseksiyon makası kullanın. Ardından, apikal kıvrımı kohleanın alt kıvrımlarından ayırın.

Apikal sarmalı korumaya özen gösterin. Çekilmemeli veya gerilmemelidir. Son olarak, dokuyu çok fazla yırtmadan apikal dönüşü kokleadan çıkarın.

Kalan kemiği çıkarmak için ince pens kullanın. Bir sonraki adım, STR of oculis ve tial membranı çıkarmaktır. Tüy hücresi bölgesinin dışında yer alan parlak doku şeridi olan STR of oculis'i dikkatlice çıkarın.

Oculis STR ile birlikte kolayca yerinden ayrılabilecek olan duyusal tüy hücrelerini çıkarmamaya dikkat edin. Ardından, tial membranı ayırmak için ince pens kullanın. Duyusal tüy hücrelerinin üzerinde yer alan parlak, yarı saydam membrandır; şimdi fazla doku ve kemiği kesin ve preparatı pensle düzleştirin.

Bu, dokunun bir iğne altına eşit şekilde yerleştirilebilmesi için gereklidir. Diseksiyon işlemi şimdi tamamlanmıştır. Hazırlanan lamelin üzerindeki iğnenin altına, diseksiyon tamamlandıktan sonra iğnenin tüy hücrelerinden uzakta konumlandığına dikkat ederek preparatı yerleştirin.

Koklear dokuyu tutan lam üzerindeki ekstraselüler sıvı damlasını koruyarak, preparatı pens yardımıyla kayıt odasına aktarın ve hemen ekstraselüler solüsyon ile perfüzyona başlayın. Preparatın daha iyi hayatta kalmasını sağlamak için mikroskobun 10 x objektifini veya 40 x su daldırmalı DIC objektifini kullanın. Preparatı konumlandırmak için, kayıt elektrotlarının iç tüy hücrelerine lateral duvarlarına dik bir açıyla yaklaşabileceği şekilde yönlendirin.

Preparatın kıvrılmış olması nedeniyle iç tüy hücrelerinin bazal bölgesinin görünürlüğü kısıtlıysa, preparatın dış kenarını cam lamelin üzerine doğru bastırmak için bir kayıt elektrodu kullanın. Bu sırada iç tüy hücrelerinin kendisine baskı yapmamaya özen gösterin. Bu preparatta, üstteki elektrot preparatın dış kenarını aşağıda tutarken, alttaki elektrot afferent batonların bulunduğu yeri işaretlemektedir.

Referans olarak, NC 70 Nuv Con kamerası, iç tüy hücresi bölgesindeki dokunun sağlıklı olup olmadığını değerlendirmek için monitörde büyütülmüş Forex görüntüsünü görüntüler. Referans noktası olarak tüy demetlerini bulun ve çekirdekleri bulmak için odağı aşağıya kaydırın. Odağı, aferent uçlarıyla birlikte iç tüy hücrelerinin tabanına doğru daha da aşağıya, ardından monitörde çekirdeklerin seviyesine ulaşana kadar tekrar yukarıya kaydırın.

Şimdi iç tüy hücrelerinin tabanı etrafındaki afferent batonları bulun. Batonlar küresel veya elipsoid şekillidir, çapları yaklaşık bir mikrondur, açık renklidirler ve parlak bir görünüme sahiptirler. Odaklamayı yukarı ve aşağı hareket ettirerek onları bulabilirsiniz.

Bir sonraki adım, uç kısmı hücre içi solüsyonla doldurulmuş bir mikron uçlu bir kayıt elektrodu kullanarak afferent liflere giden yolu açmaktır. Pozitif basınç uygulayın ve elektrodu preparata yönlendirmek için mikro manipülatörü kullanın. Preparasyondaki iç tüy hücresi tabanı seviyesinde bir insizyon yapmak için bu elektrodu kullanın.

Pozitif basınç kullanarak, destek hücrelerinin ince tabakası ile iç tüy hücreleri arasına elektrodu iterek, iç tüy hücrelerinin tabanındaki bölgeye erişim yolu oluşturun. Elektrodu dikkatlice çıkarın ve yerine hücre içi çözelti ile doldurulmuş, bir mikron uç çapına sahip yeni bir elektrot yerleştirin. Elektrot ucunun temiz kalmasını sağlamak için pozitif basınç uygulayarak, kayıt elektrodunu erişim deliği üzerinden bitişik destek hücrelerinin etrafından afferent baton yönüne doğru ilerletin.

Elektrot ucunun doğrudan afferent butonun önünde olduğundan emin olun; butonlar, pipet hareketine karşı destek hücrelerinden ve iç tüy hücresi membranından daha fazla direnç gösterir. Pipet hareket ettirilirken bu fark hissedilebilir; butonun hareket ettiğinden emin olmak için pipeti yukarı aşağı hareket ettirin ve itin. Bu durum, pipet ucunun ve butonun, elektrot afferent butona bastırılmış haldeyken aynı odak düzleminde olduğunu gösterir. Eş zamanlı olarak pozitif basıncı serbest bırakın ve giga ohm sızdırmazlık oluşturmak için vakum uygulayın.

Tam hücre kaydı elde etmek için elektrot içindeki membranı yırtmak amacıyla hafif vakum darbeleri uygulayın. Eğer patch yapılan hücre bir afferent baton ise, tam hücre kayıt modunda küçük kapasitif geçici akımlar (transientler) gözlemlenir. Bu şekil, bir afferent fiberden kaydedilen tipik geçici akımı göstermektedir.

Sinaptik aktivite kaydına başlayın. Afferent fiber spontan aktivite göstermiyorsa, daha yüksek potasyum konsantrasyonuna sahip bir ekstraselüler solüsyon uygulayarak tüy hücresini depolarize edin. Bu şekil, solda AFF fiberleri ve sağda iç tüy hücreleri için tipik akım-voltaj ilişkilerini göstermektedir.

Akım-gerilim ilişkileri, -124 mV'den +36 mV'ye kadar 10 mV'lik artışlarla uygulanan gerilim basamakları ve -84 mV'lik bir tutma potansiyeli ile kaydedilmiştir. Gerilimler, bir afferent fiberden gelen akım-gerilim ilişkilerine odaklanan bazı izlerin sağında gösterilmiştir. Uyarıcı post-sinaptik olayların veya EPC'lerin gerilim basamaklarının çoğunda mevcut olduğuna dikkat edin.

EPC'ler yaklaşık pozitif 6 mV değerinde pozitife döndü. Bu kayıt, voltaj kapılı sodyum akımlarını engellemek için tetrodotoksin varlığında gerçekleştirildi; engelleyici olmasaydı, kayıtta ek olarak hızlı aktive olan sodyum içe akımları da görülürdü ve bu durum kaydın bir afferent fiber kaydı olduğunu kanıtlardı. Hiperpolarize voltajlardaki yavaş aktive olan içe akıma dikkat ediniz.

Bu akım, iç tüy hücrelerinde veya destek hücrelerinde bulunmaz ve kaydın bir aferent fiberden yapıldığının iyi bir göstergesidir. Bu kayıtlar, bir iç tüy hücresi için akım-voltaj ilişkilerini göstermektedir. Ok, pozitif potansiyellerdeki hızlı aktive olan dış potasyum akımlarını göstermektedir.

Bunları, dar pipet çapı ve yüksek erişim direnci nedeniyle gecikmiş doğrultucu potasyum akımları takip eder. Burada gösterilen iç tüy hücresi akımları, iç tüy hücresi akımlarının doğru kayıtlarının alınması için beklenen değerden daha küçüktür. Daha düşük erişim direncine sahip pipetler kullanılmalıdır.

Buna rağmen, burada sunulan kayıtlar, iç tüy hücreleri ile afferent fiberlerin akım-voltaj ilişkilerinin net bir şekilde ayırt edilebileceğini göstermektedir. Bu şekil, bir afferent fiberden kaydedilen sinaptik akımları göstermektedir. EPC'lerin değişken boyut ve şekillerine dikkat ediniz.

Kayıtlar, voltaj kapılı sodyum akımlarını bloke etmek için tetrodotoksin uygulanarak oda sıcaklığında gerçekleştirilmiştir. Bu şekil, bir iç tüy hücresi ve onunla temas halindeki bir aferent batondan alınan eş zamanlı kayıtları göstermektedir. İç tüy hücresini depolarize etmek için bir voltaj basamağı kullanılmış ve buna yanıt olarak iç tüy hücresinden içeri doğru kalsiyum akımları kaydedilmiştir; kalsiyum girişi, nörotransmitter salınımına yol açarak aferent batondaki EPC'leri aktive eder.

Bu prosedürü uygulamaya çalışırken, 50 milisaniyelik iç tüy hücresi depolarizasyonu sırasında ortaya çıkan sinaptik depresyona dikkat edin. Koklear dokuyu diseke ederken ve hazırlarken özen göstermenin; afferent terminallerden kayıt almaya çalışırken sabırlı ve iyimser kalmanın önemli olduğunu unutmayın.