Yüksek Verimli Ekran Metagenomic Kütüphaneler selülaz Aktivitesi Biomining

Bu prosedürün genel amacı, bir metagenomik kütüphaneden selülaz eksprese eden klonları tanımlamaktır. Bu işlem, önceden hazırlanmış bir metagenomik kütüphanenin bir robot kullanılarak replike edilmesi ve ardından replike edilen kütüphanenin 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. E. coli klonlarının büyümesi ölçüldükten sonra, replike edilen kütüphaneye lizis çözeltisi, tampon ve substrat eklenir.

Sonuç olarak, bir plaka okuyucu kullanılarak kolorimetrik absorbans ölçümleri aracılığıyla selülaz aktivitesini gösteren veriler elde edilebilir. Merhaba, ben University of British Columbia, Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'ndeki Steven Hallam laboratuvarından Keith. Bugün sizlere metagenomik kütüphanelerin yüksek kapasiteli fonksiyonel taraması için bir prosedür göstereceğiz.

Metagenomik kütüphanelerden biomin selülaz aktivitesini incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu protokole başlamadan önce, 384 kuyucuklu plaka formatında saklanan bir metagenomik kütüphane hazırlayın.

Bu çalışmada, prosedüre başlamak için kütüphane konakçısı olarak Farge T one resistant TRANSFECT max EPI 300 T one resistant e coli hücreleri ile birlikte PCC one copy control SMID vektörü kullanılmıştır; kütüphaneyi içeren plakaları -80 °C'den çıkarın ve yaklaşık 20 dakika boyunca 37 °C'de çözdürün. Bu sırada, robotu 15 dakika boyunca sterilize etmek için QIX two üzerindeki UV ışık sterilizasyon özelliğini kullanın. Q fill three'yi, medya şişesi steril tüplere sahip manifolda bağlanmış şekilde üretici talimatlarına göre hazırlayın.

Q fill three cihazını uygun miktarda besiyeri ile doldurun ve 45 µL hacim dolduracak şekilde ayarlayın. Her bir kuyucukta, besiyeri görünene kadar robotun tahliye özelliğini kullanarak borulardaki ve manifolddaki havayı tahliye edin. Manifoldun her bir pininde, Q fill three kullanarak istenen sayıda plakayı LB besiyeri ile doldurun.

Her bir plakanın doldurulması yaklaşık 20 saniye sürer. Ardından, kütüphane plakalarını ve taze plakaları Q picks'in uygun alanlarına yerleştirin. Temizleme banyolarını uygun reaktiflerle robotik olarak doldurun.

Arka banyoda %2 micro 90, orta banyoda otoklavlanmış distile su ve ön banyoda %80 etanol kullanın. Qix Two'nun replikasyon programını kullanarak, uygun başlığı, ayrıca hem kaynak hem de hedef plakaların sayısını ve türlerini seçin. Ayrıca, replikasyonlar arasında temizleme yapacak şekilde başlığı ayarlayın.

Genellikle her banyoda altı döngü yeterlidir. Makinenin kapasitesi aynı anda 10 plakadır. Makineyi çalışacak şekilde ayarlayın.

Kopyalamanın yaklaşık 15 dakika sürecektir. 384 pinli başlık ile tam kapasite kullanılır. Plakalar kopyalandıktan sonra, plakaları bir nem kutusunda 37 degrees Celsius'da 24 saat boyunca inkübe edin.

Arabinoz ilavesiyle yüksek sayıda smid kopyası indüklendiği için uzun inkübasyon süresi gereklidir. Bu sırada, yazılı protokolde açıklandığı şekilde Q fill three robotunu temizleyin. İnkübasyonun ardından, plakaları 37 °C'lik inkübatörden çıkarın.

Kapakları kenara ayırın ve plakaları rapid stack ile birlikte verilen şarjör yükleme platformuna yerleştirin. Yazılım plakaların sırasını takip etmediğinden, plakaların sırasını mutlaka kaydedin. Yığının altındaki plakalar okunacaktır.

İlk olarak, hızlı yığından bir magazin çıkarın. Boş olduğundan emin olun ve okunacak plakaların yığınının üzerine itin. Magazini tutamağından kavrayın; plaka magazinin içine yüklenmelidir.

Şarjörü doğru yönde hızlı istifleyiciye yerleştirin. Bağlı bilgisayar üzerinden tarama programını açın. Yeni oturum seçeneğini seçin ve uygun şekilde adlandırın.

Plaka olarak düz dipli 384 kuyucuklu plaka seçeneğini belirleyin. Plaka düzeni alanına giriş yapın. Sihirbaz düğmesini seçin ve plakaya 384 bilinmeyen eklemek için bu düğmeyi kullanın.

Protokol alanında, kuyucuk döngüsü (well loop) seçeneğini belirleyin ve 384 kuyucuk için giriş yapın. Ekranın sol tarafındaki akış ağacında bir kuyucuk döngüsü simgesi görünecektir. Simgeyi seçin ve fotometrik ölçüm eklemek için tıklayın.

Okuma değerini 600 nanometre olarak ayarlayın. Protokolü benzersiz bir isimle kaydedin ve tarama programını kapatın. Ardından polara RS programını açın.

Ana sayfada, VARI scan başlığı altında rapid stack cihazına bağlı enstrümanların listelendiği bir tablo yer alır; buradan run session seçeneğine tıklayın. Ardından, ortasında bir akış şeması bulunan assay penceresi görünmelidir. Run session öğesini seçin ve ardından kaydedilmiş taramanın adını bulun.

Ekranın sağ tarafında beliren açılır menüden yeniden çalıştır seçeneği seçilir. Protokol seçildikten sonra "çalıştır" (run) düğmesine tıklayın. Bu analiz için, hangi magazinle kaynağın ve hangi magazinin boş olduğunun sorulduğu bir kutu açılacaktır.

Ekrandaki alt kutu, ön magazin haznesine karşılık gelir. Hem rapid stack'in hem de Vario scan'in açık olduğundan emin olun ve başlat'a tıklayın. Rapid stack, plakaları otomatik olarak plaka okuyucuya yükleyerek plakaların sürekli ölçümlerine olanak sağlayacaktır.

Makinelerin okuma işlemini doğru şekilde hizaladığından emin olmak için Vario scan'e yüklenen ilk plakayı gözlemleyin. 25 plakanın okunması yaklaşık 50 dakika sürer. Vario scan işlemi tamamlandığında, dolu magazini çıkarın ve magazin yükleme platformuna yerleştirin.

Platformun dış dikdörtgenini yukarı kaldırın; şarjör kayarak çıkacak ve plakalar ortada bir yığın halinde kalacaktır. Son olarak, çözelti tabanlı bir tarama için plakaların kapaklarını tekrar kapatın. Selüloz aktivitesi için öncelikle, önceden hazırlanmış 10 kat stok lizis çözeltisini kullanarak analiz karışımını hazırlayın.

Yazılı protokolde açıklandığı gibi pH 5.5 değerinde 50 millimolar potasyum asetat tamponu ile karıştırın. Ardından, substratın tamamen çözündüğünden emin olarak, DMSO içerisinde 75 miligram/mililitre'ye kadar kromojenik DIPHENYL veya DNP hücre biyosid substratı stok çözeltisi hazırlayın. DNP hücre biyosid stok çözeltisini, final konsantrasyonu 0.1 miligram/mililitre olacak şekilde analiz karışımına ekleyin.

Her bir plakanın yaklaşık 20 mililitre çözelti kullandığını ve ölü hacmi karşılamak için ek olarak 50 mililitrenin gerekli olduğunu unutmayın. Q fill three sistemini, her bir plakaya assay karışımını eklemek için daha önce olduğu gibi kurun. Her bir plakanın doldurulması yaklaşık 20 saniye sürer.

Sayımsal karışım eklendikten sonra, plakaları 37 °C'de 12 ila 16 saat boyunca inkübe edin. Plakaları 37 °C'lik inkübatörden nem kutusu içerisinde çıkarın. Kapakları kenara ayırın ve plakaları, daha önce yapıldığı şekilde rapid stack ile birlikte verilen magazin yükleme platformuna yerleştirin.

Taramayı yeniden programlayın ve fotometrik ölçümün 400 nanometrede okunacak şekilde ayarlanması dışında, daha önce yapıldığı gibi kurulumu gerçekleştirin. Ardından, daha önce gösterildiği üzere, parametreleri POLARA RS programına girin.

Vario tarayıcının plakaları okumasını bekleyin. Çalışma tamamlandıktan sonra plakaları çıkarın ve imha edin. Absorbans okumalarını dışa aktarmak için scan it re yazılımını açın ve seçin.

Mevcut bir dosyayı açın. Oturumun kaydedildiği dizini seçin ve listeyi genişletmek için artı simgesine tıklayın. Başlık başlığı altında, konteyner 1'den konteyner N'ye kadar etiketlenmiş seçenekler yer alacaktır. Plaka sayısına bağlı olarak, sayfanın üst kısmındaki menü çubuğundan analiz edilecek ilk plakayı seçin ve veri raporu dışa aktarma (data report export) seçeneğini belirleyin.

Plaka düzeni ve fotometrik veriler gibi dışa aktarma seçeneklerini belirleyin. Raporu görüntüle (view report) düğmesine, ardından dosya kaydet (file save) seçeneğine tıklayın. İlgili dizini seçin.

Çıktı formatı bir Microsoft Excel hesap çizelgesidir. Burada, pozitif bir klon içeren tek bir 384 kuyucuklu plaktan alınan absorbans okumaları gösterilmektedir; pozitif klonlar, sellülaz aktivitesi göstermeyen klonlarla karşılaştırıldığında absorbansta belirgin bir artış sergiler.

Analiz süresi, kuyucuk, plaka üzerindeki konum veya DNP konsantrasyonundaki farklılıklar, mutlak absorbans okumalarını etkileyebilir. Plaka ortalamasının veya sütun ortalamasının üzerindeki absorbans farkı gibi göreceli absorbans okumaları, sellülaz pozitif klonların tanımlanmasında daha güvenilir bir yöntemdir. Size, bir metagenomik kütüphaneden sellülaz pozitif klonların nasıl tanımlanacağını göstermiş olduk.

Bu prosedürü uygularken, DNP hücre biyolojik yan ürününü DMSO içinde çözmeyi ve plaklarınızı bir nem odasında inkübe etmeyi hatırlamanız önemlidir. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.