Damla Akış ve Döner Disk Reaktörler kullanın Staphylococcus aureus Biyofilm Analizi

Bu prosedürün genel amacı, damla akışlı biyofilm reaktörü veya döner disk reaktörü kullanılarak düşük veya orta düzeyde kayma kuvveti altında bakteriyel biyofilmler büyütmektir. Biyofilm reaktörlerindeki kuponlar, önce bakterilerle inoküle edilir ve bakteriyel hücrelerin büyüme yüzeylerine tutunmalarını sağlamak için 37 °C'de inkübe edilir. Hücreler kuponlara tutunduktan sonra, biyofilm gelişimi sırasında etki eden bir kayma kuvveti oluşturan büyüme besiyeri akışı başlatılır.

Olgun biyofilmler daha sonra analiz ve biyofilmlerin gözlemi için toplanabilir. Üretilen biyofilmlerin ultrastrüktürünü belirlemek için taramalı elektron mikroskobu kullanılabilir. Ben Blaze Balls.

Bu tekniğin akış hücreleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, yüksek biyokütle üretiminin ve çok sayıda özdeş biyofilmin kolaylıkla elde edilebilmesidir. Bu prosedürü, laboratuvarımdan bir teknisyen ve lisansüstü öğrencisi olan Rachel Stevenson ve Kelly Schwartz uygulamalı olarak gösterecekler. Damla akışlı biyofilm reaktörü, besiyeri girişi için giriş portları ve atık çıkışı için çıkış portları olan dört odacıktan oluşur.

Her bir bölmenin içinde, biyofilmin üzerinde büyüdüğü çıkarılabilir bir kupon bulunur. Damlama akışlı biyofilm reaktörünü kurmak için, kuponları her bir paralel bölmeye yerleştirin ve bölme kapaklarını sabitleyin. Sistemi kullanmadan önce sterilize etmek için kurulu reaktörü ve besin giriş tüplerini otoklavlayın.

Sterilize edilmiş damla akış reaktörünü inoküle etmek için biyofilm büyüme besiyerini de otoklavlayın. Cihazı düz bir yüzeye yerleştirin ve çıkış hatlarını kelepçeleyin. Ardından, her bir bölmeyi 10 milliliters sterile triptiç soya brok bazlı büyüme besiyeri ile doldurun ve 100 microliters staphylococcus aureus ekleyin.

Gece boyu kültür, her bir bölmeye ayrı ayrı aynı ortamda büyütülür. Hücrelerin kupon yüzeyine tutunmasını sağlamak için inoküle edilen reaktörü 37 °C'lik bir inkübatöre 18 saat boyunca yerleştirin. İnkübasyonun ardından, çıkış borusunu klempleyin ve reaktörü 10 derecelik bir açıyla eğimli ahşap bir blok üzerine yerleştirin. Aseptik olarak.

Akışkan besiyeri tüpünü, sürekli akışlı besiyeri içeren bir şişeye bağlayın. Tüp hattını pompanın içinden geçirin ve pompayı tam hızda çalıştırarak tüpteki havayı boşaltın. Akışkan tüplerdeki hava boşaltıldıktan sonra pompayı durdurun ve her tüpün ucuna 22 gauge bir inçlik iğneler takın.

Kamar giriş tıpasına etanolle aseptik bir şekilde silme işlemi uygulayın. İğneleri giriş tıpası üzerinden içeri yerleştirin. Pompayı çalıştırın ve besiyerinin kuponların üzerine damlamasını sağlayın.

Yaklaşık 125 µL/dakika akış hızında, besiyeri giriş tıpası portundan çıkış portuna doğru aşağı doğru akmalıdır. Reaktörü üç gün boyunca sürekli akış modunda çalıştırın. Bu sırada reaktörü uygun drenaj açısından ara ara kontrol edin.

Besiyerinin odacıklarda birikmediğinden emin olmak için odacıklar görsel olarak kontrol edilerek drenaj denetlenir. Eğer besiyeri birikiyorsa, çıkış tüpünü sıkıştırmak genellikle biyofilmleri hasat etmek için uygun drenajı teşvik eder; pompayı durdurun ve iğneleri reaktörden çıkarın. Ardından reaktörü düz bir yüzeye yerleştirin.

Üç günlük sürekli akışın ardından, Staphylococcus aureus biyofilmleri, inoküle edilen kuponların uzunluğu boyunca yayılmış sarı biyokütleler olarak görülür. Biyofilmin taramalı elektron mikroskobu görüntüsü, Staphylococcus aureus'un kuponu yüzeyle ilişkili bir biyofilm topluluğu şeklinde kapladığını ortaya koyar. Elde edilen biyokütleyi nicelleştirmek için, steril pensler kullanarak kuponları aseptik bir şekilde çıkarın, bakterileri bir hücre kazıyıcı kullanarak toplayın ve ardından bunları beş mililitre steril PBS içeren konik bir tüpe aktarın.

Bir doku homojenizatörü kullanarak, homojen bir süspansiyon elde edilene kadar bakteriyel kümeleri dağıtın. Koloni oluşturan birimler, seri dilüsyonların triptik soya agar plaklarına ekilmesi, 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edilmesi ve kolonilerin sayılmasıyla belirlenir. Döner disk biyofilm reaktörü, içinden büyüme ortamının pompalandığı bir kemostattan oluşur.

Yıldız çubuklu bir döner disk ve döner diske uyacak şekilde tasarlanmış 18 kupon. Reaktörü monte etmek için öncelikle döner disk kuponlarını döner diskin yuvalarına yerleştirin. Ardından, yüklü diski taşma portuna sahip bir litrelik bir cam behere yerleştirin ve reaktörü, biri medya akışı ve diğeri havalandırma için bir deliğe sahip 15 numara bir kauçuk tıpa ile kapatın.

Sistemi sterilize etmek için otoklavda kurulu reaktörü ve giriş borularını sterilize edin. Reaktörü inoküle etmek için, beheri 250 milliliters steril kültür ortamı ile doldurun ve triptych soy broth içerisinde büyütülmüş staphylococcus aureus gecelik kültüründen 500 microliters ekleyin. Reaktörü dakikada 250 devir olarak ayarlanmış bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin ve hücrelerin kuponlara yapışmasını sağlamak için 37 degrees Celsius sıcaklıkta gecelik olarak inkübe edin.

Gece boyu inkübasyonun ardından, giriş borusunu besiyeri rezervuarındaki porta ve peristaltik pompaya bağlayın. Pompayı çalıştırın ve akışı 0.25 milliliters per minute olarak ayarlayın. Oluşan biyofilmleri toplamak için reaktörün 37 degrees Celsius'de 24 saat boyunca çalışmasına izin verin.

Reaktörü durdurun ve aseptik koşullarda işlemi gerçekleştirin. Kuponlara dokunmadan diski çıkarın. Steril pensler kullanarak kuponları çıkarın ve antimikrobiyal bileşik testi için gevşekçe tutunmuş bakterileri temizlemek amacıyla her birini dikkatlice steril PBS içine daldırın.

Kuponları, ilgilenilen bileşikleri içeren 96 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aseptik olarak yerleştirin. Plakayı 37 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. Ardından kuponları, 1x PBS içeren 1,5 mL'lik mikro santrifüj tüplerine aktarın ve biyofilmleri bir homogenizatör kullanarak dağıtın.

Son olarak, örnek başına canlı koloni oluşturan birim sayısını belirlemek için, daha önce açıklanan şekilde hücrelerin seri dilüsyonlarını besiyeri agar ortamına ekiniz. Bu grafik, dönen disk reaktörü kullanılarak hazırlanan ve hidrojen perokside maruz bırakılan biyofilmlerdeki koloni oluşturan birim sayısını ve 18 adede kadar özdeş biyofilm üretme kapasitesini göstermektedir. Dönen disk reaktörünün kullanımı, bu tekniği antimikrobiyal bileşik testleri için ideal hale getirmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, damla akışlı (drip flow) ve döner diskli reaktör biyofilmlerinin nasıl çalıştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu biyofilm reaktörleri, akış hücresi ve mikrotitrasyon plakası biyofilmlerine alternatifler sunar ve yüksek miktarda biyofilm biyokütlesine ihtiyaç duyulduğunda veya yerleşmiş biyofilmler üzerinde antimikrobiyal testler yapılmak istendiğinde idealdir.