Subkutan Enfeksiyon Metisiline Dirençli Stafilokok Aureus (MRSA)

Aşağıdaki deneyin genel amacı, metisiline dirençli staphylococcus aureus veya MRSA'nın sağkalımını ve yayılımının yanı sıra enfeksiyon bölgelerindeki kemokin ve sitokin seviyelerini incelemektir. Bu, net bir gözlem alanı sağlamak için farelerin sırtlarındaki tüylerin temizlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak.

Süspansiyon halindeki MRSA, enfeksiyondan üç gün sonra farelere deri altına uygulanacaktır; enfeksiyon patolojileri ve bakteri sayıları, doku homojenatlarından agar plakları üzerindeki koloni oluşturan birim sayısının belirlenmesiyle değerlendirilebilir. Merhaba, nasılsınız? Benim adım De Lordon.

Ben bir doktora sonrası araştırmacıyım. Merhaba, benim adım Mariel Sanchez. Ben bir doktora öğrencisiyim ve ben de Andrea Huda.

Ben bir araştırma görevlisiyim; Cedar-Sinai Tıp Merkezi pediatri bölümündeki George Lee'nin laboratuvarında görev alıyoruz. Bu yöntem; miyozit, polimiyozit ve nekrotizan fasiyitis dahil olmak üzere ağır enfeksiyonların modellenmesi gibi tıp alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem ağır acil enfeksiyonlar hakkında bilgi sağlayabilmenin yanı sıra, grup A streptokoklar ve diğer organizmalar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Ek olarak, miyozit ve polimiyozite neden olan diğer organizmaların fonksiyonlarını ve patogenezini inceleyebiliriz. Genellikle, bu prosedürde yeni olan kişiler zorluk yaşayabilirler çünkü caucus alanlarının küresel düzenleyicilerinden biri oldukça değişkendir. Önlem alınmazsa, toplanan verilerde anlamlı varyasyonlar oluşabilir ve bu durum verilerin yorumlanmasını zorlaştırabilir.

Hadi başlayalım. BSL 2 düzeyindeki bir tesiste, TSA bazlı bir koyun kanlı agar plakası ve dondurulmuş blok kullanarak steril bir öze hazırlayın. Stok Mercer kültürünü -80 °C'lik depolama alanından çıkarın.

Ardından, steril öze yardımıyla stok kültürden küçük bir buz parçası koparıp plağa aktarın. Mercer stok kültüründen küçük bir parça aldıktan sonra, tekrarlanan dondurma ve çözme işlemleri stok kültüre zarar vereceğinden, çözünmeyi önlemek için stok kültürü derhal dondurucuya geri koyun. Tekil Mercer kolonilerinin büyümesini sağlamak için öze ile agara ekim yapın.

Plakayı, CO2 takviyesi olmadan 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün; yeni bir kanlı agar plakası, bir TSA plakası ve üç mL THB içeren 15 mL'lik kapaklı bir tüp hazırlayıp etiketleyin.

Gece boyu kültürlenen M SSA plağını alın ve kolonilerin hemolitik fenotipini inceleyin. Steril bir öze kullanarak, önceki deney kolonileriyle tutarlı bir fenotipe sahip olan bir koloni seçin. Aynı öze ekim yöntemiyle, seçilen koloniyi THB'ye inoküle edin.

Plakadaki THB çözeltisini 37 °C'de, dakikada 220 devir hızında çalkalamalı olarak gece boyunca inkübe edin. Bu bakteriler, sonraki aşamalarda farelerin deri altı enfeksiyonu için kültür inokülasyonunda kullanılacaktır. Kanlı agar plağını da inkübatöre yerleştirin.

Plaka, ertesi sabah THB çözeltisindeki bakterilerin hemolitik fenotipinin, başlangıçta seçilen koloninkle eşleştiğini doğrulamak için kullanılacaktır. Hemoliz fenotipi orijinal klon ile tutarlı değilse, deneye başlamayın. Fareyi bir platforma transfer edin ve sırtındaki tüyleri tıraş edin.

Hayvan aşırı agresifse, izofloran ile sedasyon gerekebilir. Tıraş edilen bölgeye NA gibi bir tüy dökücü kremden yaklaşık beş kübik milimetre uygulayın. NA, yerel eczanelerden satın alınabilir.

Bebek yağı içeren tüy dökücü kremi satın aldığınızdan emin olun, çünkü bebek yağı içermeyen ürün fareler için fazla uyarıcı olacaktır. Kremin cilt yüzeyinde yaklaşık bir dakika boyunca inkübe olmasına izin verin; krem inkübe olurken birkaç kağıt havluyu çift distile su ile ıslatın. Tıraş edilen bölgeyi temizlemek için ıslak kağıt havluları kullanın.

Cildin tüy dökücü kremden arındırıldığından emin olun; 50 mL'lik vidalı kapaklı bir tüp içinde 10 mL THB'yi bir bakteri inkübatöründe 37 °C'de dört ila 10 saat boyunca ön ısıtmaya tabi tutun. Gece boyu büyütülen bakteri kültüründen 20 µL'yi ön ısıtılmış THB'ye aktarın. Bu işlem, gece boyu büyütülen merc'yi seyreltecektir.

1:500 oranında bir süspansiyon hazırlayın. Tüpü 37 °C'de, dakikada 220 devir hızındaki çalkalamalı bir inkübatörde yaklaşık iki buçuk ila üç saat boyunca bekletin. Bakteri süspansiyonunu 1:10 oranına kadar daha fazla seyreltmek için daha fazla THB kullanın ve süspansiyonu bir spektrofotometre ile ölçün.

514 nanometre absorbansında. 1/10 oranında seyreltilmiş süspansiyon 0,25 değerine ulaşana kadar, süspansiyonu 37 °C'de, dakikada 220 devir hızında çalkalayarak inkübe etmeye devam edin. M'yi toplamak için, 50 ml'lik tüpü 4 °C'de 10 dakika boyunca 3.225 ×g'de santrifüj edin, süpernatantı atın ve yeniden süspanse edin.

Bakteriyel pellet'i 10 mililitre DPBS içerisinde süspande edin ve bu şiddetli enfeksiyon modeli için santrifüj adımını tekrarlayarak bakterileri yeniden yıkayın. Bakteriyel pellet'i yaklaşık bir mililitre DPBS içerisinde yeniden süspande ederek mililitre başına yaklaşık 1 × 10¹⁰ koloni oluşturan birim elde edin. Koyun kanlı A-R-T-S-A plaklarını hazırlayın ve bakterileri DPBS içerisinde 10¹'den 10⁸'e kadar seri şekilde dilüye ederek plağa ekleyin.

Seri dilüye edilmiş bakteri süspansiyonundan 10 µL'lik damlaları, kanlı agar plaklarına üç tekrar halinde damlatın. Plakları 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Plakları 16 ila 18 saat inkübe ettikten sonra, inokülumun hemoliz fenotipini gözlemleyin ve kaydedin.

Plakalardaki koloni oluşturan birim sayısını belirleyin. Enfeksiyon inokülumu, plakalardaki koloni oluşturan birim sayısına göre hesaplanacaktır.

Daha önce hazırlanan DPBS içindeki bakteriyel süspansiyondan 100 µL ile bir şırınga hazırlayın. Enjeksiyondan önce, farelerin solunum hızının saniyede yaklaşık bir kez olacak şekilde sedatize edilmesi gerekir. Gösterim amacıyla, bu videoda ötanize edilmiş bir fare gösterilmektedir.

Enjeksiyondan sonra M serini bir flank bölgesine enjekte edin. Fareyi tekrar kafesine transfer edin. Fareyi hayvan odasına geri götürmeden önce canlı olduğundan emin olmak için enjeksiyondan sonra hayvanları üç ila beş saat boyunca gözlemleyin.

Hayvanlar sakrifiye edildikten sonra, sırtlarındaki lezyonları günlük olarak izleyin. Derideki lezyonların boyutunu ve durumunu ölçün ve kaydedin. Hem deri hem de kas lezyon alanları, lezyonun milimetre cinsinden uzunluğu ve genişliği çarpılarak nicelendirilir.

Düzensiz şekilli lezyonlar daha küçük simetrik parçalara ayrılmalı ve her bir parça aynı yöntemle ölçülmelidir. Doku toplama işlemi için 100 µL DPBS içeren 1,5 mL mikro santrifüj tüpleri hazırlayın. Steril bir jiletle cildi hafifçe kesin ve lezyonu steril bir makasla eksize edin.

Lezyon eksize edilirken, bölgeyi çevreleyen yaklaşık iki ila beş milimetrelik sağlıklı derinin de eksize edildiğinden emin olun. Kas lezyonlarının analizi için lezyonu doku toplama tüplerine yerleştirin. Kas dokusundaki lezyonun boyutunu ölçmek ve durumunu kaydetmek için deriyi dikkatlice soyun.

Dalak ve böbrekleri toplayın. Bu dokuları kendilerine ait ayrı toplama tüplerine yerleştirin. Dokuları, bir mililitrelik bir şırınga ile yaklaşık 30 saniye boyunca çalkalayarak homojenize edin.

Her tüpe 900 µL DPBS ekleyin. THA plaklarını hazırlayın ve homogenize edilmiş doku örneklerini beş dakika boyunca vorteksleyin. Örneği seri olarak seyreltin.

Süspansiyonlar 10¹ ile 10⁶ kat arasında seyreltilir. 96 kuyucuklu plakalara, seri dilüsyon yapılmış her bir süspansiyondan 10 µL dağıtın. Plakaları 37 °C sıcaklıktaki bakteri inkübatöründe gece boyunca inkübe edin.

Ertesi sabah, plakalardaki koloni oluşturan birimlerini sayın ve dilüsyon faktörlerine dayanarak koloni oluşturan birim sayısını hesaplayın. Enfeksiyon işlemi doğru yapıldıysa, deri altına yapılan enjeksiyondan hemen sonra cilt yüzeyinde bir kabarıklık gözlemlenecektir. Kabarıklık gözlemlenmezse, enjeksiyon çok derin yapılmış olabilir ve bu durum enfeksiyon sonucunu etkileyebilir.

Lezyon boyutu ve bakteriyel sağkalım, MSA ile enfeksiyondan sonra çeşitli zaman noktalarında değerlendirilebilir. Aşağıdaki cilt lezyonları, enfeksiyondan sonraki üçüncü günde incelenmiş olup, bir flankına 1×10⁷ koloni oluşturan birim enfekte edilmiş bir CD1 faresindeki lezyon örnekleridir. Kas lezyonları tipik olarak cilt lezyonlarının altındaki dokuda bulunur.

Aşağıdakiler, daha önce gösterilen deri lezyonu fotoğraflarıyla örtüşen kas yüzeyi lezyonu örnekleridir. Bunlar, 1 × 10⁷ koloni oluşturan birim ile enfekte edilmiş bir farede, enfeksiyon sonrası üçüncü günde gözlemlenen kas lezyonlarıdır. Lezyon alanı, milimetre cinsinden ölçülen lezyonun uzunluğu çarpı genişliği olarak belirlenir ve derideki doku hasarını değerlendirmek için ölçülebilir.

Enfeksiyon bölgesinde yerleşmiş bakterilerin koloni oluşturan birim sayısı, eksize edilen lezyonlar üzerinde miktarlandırılabilir. Koloni oluşturan birim sayısı, bir virülans faktörünün MSA'ya bir sağkalım avantajı sağlayıp sağlamadığını belirtebilir. Bu prosedür uygulanırken, iğne ve yüksek derecede patojenik mikropların kullanımı nedeniyle standart güvenlik önlemlerinin alınması gerektiğini unutmamak önemlidir.

Absse modeli olarak son olarak, modelimize kıyasla 1.000 kat daha düşük bir inokulum kullanılması, kalıcı RSA enfeksiyonunu destekleyen S faktörleri nelerdir gibi ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Mars A ile doldurulmuş şırıngalarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve şırınganın doğrudan kesici-delici alet kutusuna atılması gibi önlemlerin, iğnenin yanlışlıkla batırmasını önlemek için önemli olduğunu unutmayın. Ayrıca, bu deney için, çalışma alanının uygun şekilde dezenfekte edilmesini sağlamak adına standart BSO2 protokollerine uymak önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler. Merhaba. Merhaba, hoşça kalın.