Maya Colony Gömme Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, maya kolonilerini gömmektir. Bu işlem, öncelikle bir koloninin ve altındaki agarın bir agar plakasından çıkarılması, erimiş agar damlalarının üzerine yerleştirilmesi ve hızla daha fazla erimiş agar ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, koloninin bir kalıba sığacak kadar küçük olması için fazla agar budanır.

Ardından, AER gömülü koloni fikse edilir, boyanır,ydehidre edilir ve son olarak spurs resin ile infiltre edilir. Blok, ek spurs resin içeren bir kalıba yerleştirilip sertleşene kadar inkübe edilir ve ardından kesitler alınır. Nihayetinde, ışık veya elektron mikroskobu aracılığıyla bir maya kolonisi içindeki hücre tiplerinin dağılımını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin taramalı elektron mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, koloninin iç yapısının belirlenmesine olanak tanımasıdır. Bu yöntem, koloniler içindeki hücre tipi dağılımı gibi mikrobiyal gelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, croce CAC kolonilerinin yapısına dair içgörü sağlamıştır ancak diğer mikroorganizmalara da uygulanabileceği muhtemeldir.

Kolonilerin işlenmesi ve gömülmesi yazılı bir protokolden öğrenilmesi zor olabileceğinden, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Bu yöntem fikri, sporların kolonilerde eşit dağılmadığını öne süren ve 2002 yılında yayınladığımız bazı genetik verilerden esinlenilmiştir. Fin laboratuvarında Engelberg tarafından geliştirilen koloni kesit alma yöntemini uyarladık.

Hadi başlayalım. İlk olarak, yaklaşık 300 koloni oluşana kadar Wild S visi mayasını 30 °C'de agar plaklarında inkübe edin. İnce bir spatula kullanarak, plakadan birer birer bir ila iki milimetre çapındaki kolonileri alın.

Ardından, bir mililitrelik pipet ucu kullanarak bir mikroskop lamı üzerine 42 °C'deki %2'lik agar çözeltisinden birkaç damla damlatın ve AER katılaşmadan önce koloniyi hemen agar üzerine yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Koloninin üzerine birkaç damla daha agar ekleyin ve koloninin üst kısmı dahil tamamının agarla kaplandığından emin olarak agarın katılaşmasını bekleyin. Sonraki tüm protokol adımlarında bir jilet kullanın.

Koloninin etrafındaki AER kısmını kesin ve koloniyi içeren AER bloğunu yerleştirin. %2 paraformaldehit ve %2 glutaraldehit fiksatör içeren 3,5 mililitrelik borosilikat vidalı kapaklı flakonda, kurumayı önlemek için koloniler tek tek işlenmelidir, ancak aynı flakona 10 koloniye kadar yerleştirilebilir. Kolonileri dört derece santigrat sıcaklıkta yedi gün boyunca bekletin.

Bir hafta sonra fiksatif kaldırılır ve agri kolonileri, pH 7.2'de yaklaşık 1,5 mililitre 0,15 molar sodyum kate kullanılarak iki kez yıkanır; her yıkamanın ardından 15 dakika boyunca karıştırmadan buz üzerinde inkübe edilir. Bu yıkama işlemi iki kez daha tekrarlanır.

100 millimolar mono potasyum fosfat ve pH 6.0'da 10 millimolar magnezyum klorürden oluşan 1.5 mililitre bir X OS tamponu kullanarak, her yıkama sonrası buz üzerinde beş dakika inkübasyon yapın. Ardından, aynı tüpü kullanarak, burada ve bu protokolün yazılı kısmında belirtilen osmiyum işlemini ve yıkamaları gerçekleştirin. Daha sonra yine aynı tüpü kullanarak, burada ve beraberindeki yazılı protokolde belirtilen kademeli dehidrasyon işlemlerini ertesi sabah erken saatlerde uygulayın.

Burada ve beraberindeki yazılı protokolde gösterildiği gibi spurs reaktifini hazırlayın. Agri bloklarını, oda sıcaklığındaki %100 etanolün 1,5 mililitresi ile her biri 10 dakika sürecek şekilde hemen beş kez yıkayın. Son etanol yıkamasından sonra, agri bloğu kapalı kalacak kadar etanol bırakarak geri kalanını uzaklaştırın.

Pastör pipeti kullanarak, flakona yaklaşık 0.5 milliliters spurs reaktifi koyun ve düşük hızda bir döndürücü üzerinde 15 dakika boyunca döndürün. Döndürme işleminden sonra oda sıcaklığında, flakonu 30 dakika boyunca bekletin. Ardından, solüsyonu tamamen uzaklaştırın.

Ardından, agri bloğu kaplayacak şekilde 1,5 milliliters spurs reaktifi ekleyin. Vial'i oda sıcaklığında 15 dakika boyunca tekrar bir tekerlek üzerinde döndürün ve 30 dakika boyunca bekletin. Bu yıkama işlemini tekrarlayın.

Üç kez daha tekrarlayın. Son 30 dakikanın ardından, spurs reaktifini çıkarın ve blokları kaplayacak şekilde taze spurs reaktif ekleyin. Agri blokları oda sıcaklığında dört saat boyunca bekletin.

Spurs reaktifini yenileyin ve gece boyunca döndürün. Ertesi sabah, spurs reaktifini tekrar yenileyin ve vialleri bir sonraki güne kadar döndürmeye bırakın. Bir sonraki sabah, kalıpların tabanını hafifçe kaplayacak şekilde numaralandırılmış silikon kalıplara spurs reaktifi yerleştirin.

Ardından agri bloklarını kalıplara yerleştirin ve 60 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. Dört saat sonra, kalıpların üzerini daha fazla gömme blok ve reaktif ile tamamlayın ve 60 °C'de gece boyunca inkübe edin. Kesim işlemi için blokları kalıptan çıkarın.

Burada, bir Wild S Visia maya kolonisinin merkezinden alınan bir kesitin ışık mikrografı örneği gösterilmektedir. Bu maya, ağaç eksudalarından izole edilmiş bir vahşi tip suştur. Koloni, kesme işleminden önce altı gün boyunca YNA ortamında inkübe edilmiştir.

Bu görüntüde asai, psödohif ve ovoid mayalar kolayca ayırt edilebilmekte ve koloninin altındaki agara nüfuz ettiği bölge de belirgin şekilde görülmektedir. Açık oklar temsili asaileri, dolu oklar temsili ovoid vejetatif hücreleri, dolu ok başları ise uzamış hücre zincirlerini ve si'yi göstermektedir. Bu görüntü, laboratuvar mayası suşları SH 1 0 2 0 ve W 3 0 3'ün ince bir kesitinden alınan bir elektron mikrograf örneğidir. Arka plan.

Koloni, kesit alınmadan önce altı gün boyunca YNA besiyerinde inkübe edildi. Görüntü, koloninin sporülasyon göstermiş hücrelerin yüksek frekansta bulunduğu bir bölgesini göstermektedir. Bir ok, spor duvarının çift katmanlı yapısını işaret etmektedir.

A bölümünde, dört günlük bir koloninin kesiti ile B bölümündeki görüntü üzerine bindirilmiş 15 dikdörtgenden oluşan bir ızgara gösterilmektedir. Her bir dikdörtgendeki spor ilişkili hücrelerin sıklığı, A bölümünde gösterilen 15 dikdörtgene karşılık gelen 15 çubukla grafik haline getirilmiştir. Veriler, dört bağımsız dört günlük koloninin ortalaması ve standart hatasıdır. C bölümünde, dört bağımsız sekiz günlük koloni için ortalamalar ve standart hatalar gösterilmektedir. Bu teknik bir kez kavrandığında, bir tam gün ve birkaç tane bir ila üç saatlik günle iki hafta içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedür uygulanırken, blokların kurumaması için çözeltilerin hemen eklenmesinin hatırlanması önemlidir. Bu prosedürü takip edin.

Gelişimden sonra belirli proteinleri eksprese eden hücrelerin dağılımını belirlemek için immün elektron mikroskopi gibi diğer yöntemler de kullanılabilir. Bu teknik, sadece sporüle hücrelerin paternine değil, aynı zamanda croce CCI kolonilerindeki psödohifal hücrelerin paternine de bakmamıza olanak tanıdı. Bu videoyu izledikten sonra, maya kolonilerinin kesit alma işlemi için nasıl gömüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu protokolde kullanılan mikroskopi reaktiflerinin çoğunun son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Lütfen çeker ocak kullanmayı, koruyucu kıyafetler giymeyi ve reaktifleri uygun şekilde bertaraf etmeyi hatırlayın. Tamam, işte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler. Deneylerinizde başarılar dileriz.