C2C12 Myoblast Hücreler kullanarak Bioenerjetik bilgileri Deney

Aşağıdaki deneyin genel amacı, XF 96 hücre dışı akış analizörü kullanılarak oksidatif metabolizmanın birden fazla parametresini ölçmek suretiyle canlı hücrelerdeki ve izole mitokondrilerdeki mitokondriyal fonksiyonel durumun test edilmesidir. Bu parametreler bazal respirasyon, ATP döngüsü, proton sızıntısı ve maksimal respirasyon veya yedek solunum kapasitesidir. Bu işlem, C2C12 miyoblast hücrelerine mitokondriyal respirasyonun spesifik modülatörlerinin ardışık olarak eklenmesi ve respirasyonun bir göstergesi olan oksijen tüketim hızındaki (OCR) değişim ile glikoliz yoluyla ATP üreten glikozun laktata dönüşümünün ölçülmesiyle gerçekleştirilir.

Hücrelerdeki diğer ana enerji yolu da ECAR veya hücre dışı asidifikasyon hızı olarak ölçülür. Hücrelerin yaşam süresinin belirlenmesinde mitokondriyal fonksiyonun oynadığı merkezi role dair içgörü sağlayan mitokondriyal profilleme sonuçları elde edilebilir. Merhaba, benim adım David Nichols.

Kariyerim boyunca mitokondriyal çalışmalar üzerine yoğunlaştım ve araştırmalarımda kullandığım en önemli ekipman oksijen elektrodu oldu. İzole mitokondrilerle, farklı koşullar altında oksijen tüketim hızını ölçebilirseniz, son derece önemli veriler elde edersiniz. Ancak hücrelere, özellikle çok kuyucuklu plakalarda veya lamella üzerinde kültüre edilmiş hücrelere geçtiğinizde, klasik yöntemler işe yaramaz.

Bu, birkaç yıl önce çok kuyucuklu plaka formatında hücrelerin respirasyonunu paralel olarak incelememize olanak tanıyan çok kuyucuklu plaka analizinin geliştirilmesiyle aşılan önemli bir sorundur. Bugün göreceğiniz, kültürlenmiş hücrelerdeki temel mitokondriyal biyonerjetik fonksiyonu izlemek için tasarladığımız, oldukça basit ancak bilgi açısından zengin bir deneydir. Başlamak için, hücreleri XF 96 hücre kültür plakalarına, kuyucuk başına 100 µL büyüme ortamında 10.000 hücre olacak şekilde ekleyin ve %10 CO2 içeren 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.

Hücreler, ekimden 24 saat sonra XF 96 cihazında analiz edilebilir. Deney sihirbazı, aşağıdaki grup düzenine sahip bir şablon oluşturur. Birden on ikiye kadar olan tüm sütunlar 10.000 C two C 12 hücresi içerir.

Mavi renkli birinci grup kontrol hücreleri olarak kullanılır. Kırmızı renkli ikinci gruba oligo Mycin, FCCP ve roone ilaçları uygulanacaktır. Ardından, protokolün yazılı bölümünde açıklandığı şekilde bileşikleri X-F-D-M-E-M assay ortamında hazırlayın.

Oligo Mycin, FCCP ve rotenon. Bu bileşikler XF hücre MIT stres testi kitinde önceden dispense edilmiştir. XF hazırlama istasyonunu kullanarak, büyüme besiyerini DMEM çalışma besiyeri ile değiştirin.

Son olarak, enjekte edilebilir bileşikler sensör kartuşuna eklenmeden önce hücrelerin assay Medium ile ön dengeye gelmesini sağlamak için hücreleri, karbondioksit içermeyen 37 °C bir inkübatörde 60 dakika boyunca inkübe edin; bileşikleri 37 °C'ye getirin. Ardından, bileşikleri enjektör portlarına şu şekilde yükleyin. Birinci ila dördüncü kolonlar için, A, B ve C portlarına sırasıyla 16, 18 ve 20 µL XF assay medium veya DMEM yükleyin.

Beşinci ile on ikinci sütunlar için, port A'ya 16 µL oligomycin, port B'ye 18 µL FCCP ve port C'ye 20 µL rotenon yükleyin. Ardından, protokol komutlarını şu şekilde tanımlayın: döngü sayısını üç olarak ayarlayın, karıştırma süresini üç dakika ve ölçüm süresini üç dakika olarak belirleyin. Son olarak, başlat'a tıklayın.

Kalibrasyon tamamlandığında kartuşun ne zaman yükleneceğini belirten ekrandaki talimatları izleyin. Kullanıcı istemlerini takip ederek deney için hücre plakasını ekleyin. Ardından devam'a tıklayın ve analizin çalışmasına izin verin.

Deney sona erdiğinde plakayı çıkarın. Bu Analiz, mitokondriyal fonksiyonu profillemek için yapılan klasik deneyden türetilmiştir ve çeşitli bileşiklerin hücre metabolizması, mitokondriyal fonksiyon ve genel biyoenerjetik aktiviteler üzerindeki etkilerini anlamaya yönelik daha karmaşık deneyler oluşturmak için bir çerçeve görevi görür. Burada, hücrelerin her bir bileşik ile sırasıylale tedavi edilmesi sonucunda oksijen tüketim hızında beklenen yanıt gözlemlenmiştir.

Ligamisin tedavisi sonucunda, mitokondriyal kompleks beşte ATP sentezinin engellenmesi nedeniyle ATP miktarı azalmıştır. Hücreler, ligamisin uygulamasından sonra oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP sentezleyemedikleri için, ATP ihtiyaçlarını karşılamak amacıyla glikolize geri dönmüşlerdir. Bu nedenle, daha önce gösterildiği üzere glikolizin bir göstergesi olan ECAR'da (hücre dışı asidifikasyon hızı) bir artış gözlemledik. FCCP, bir ayrıştırıcı ajan olarak görev yapar ve protonların geri girişindeki kısıtlamayı ortadan kaldırır.

Solunum hızlanır ve artık elektron taşıma sistemi ile sınırlanır. Son olarak, rotenon mitokondriyal kompleks birini inhibe eder; bu durum, elektron taşıma zincirindeki elektron akışının durmasına neden olur ve böylece oksijen tüketimi önemli ölçüde azalır. Burada hücrelerin bazal solunumu, oksijen tüketiminin ATP üretimine ayrılan yüzdesi ve proton sızıntısı nedeniyle proton gradyanının korunmasına ayrılan miktar hakkında bilgi elde edilir.

Ayrıca, bazen yedek solunum kapasitesi olarak adlandırılan, ayrıştırılmış solunum koşulları altında maksimal solunum hızını elde edebiliriz. Ve son olarak, mitokondriyal süreçlerden kaynaklanmayan oksijen tüketim miktarını belirleyebiliriz. Az önce Seahorse ile bunu gördünüz.

XF 96, hücredeki mitokondrilerin BIE enerjetikleri hakkında muazzam miktarda bilgi veren bir dizi deneydir. Çok önemli olan temel deneyi, deney bir olarak adlandırıyoruz; bu deney size bazal respirasyon, ATP döngüsü, mitokondriyal proton sızıntısı ve yedek solunum kapasitesi hakkında bilgi sağlar. Bu parametreler, hücredeki mitokondrilerin biyoenerjetik durumu hakkında bu temel bilgileri sunar.