Serebral Vasküler Endotelyal Hücrelerinde Bioenerjetik Fonksiyonun Değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel hedefleri, mitokondriyal fonksiyon değişikliklerinin nörolojik bozuklukların gelişimini nasıl etkilediğini değerlendirmek ve kan-beyin bariyeri açıklıkları üzerinde doğrudan etkisi olan terapötikler tasarlamaktır. Bu yöntem, inme sonrası nöronal hücre ölümü nasıl en aza indirilebilir gibi nörolojik bozukluklar alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tüm sağlam hücrelerde mitokondriyal fonksiyonun gerçek zamanlı bir değerlendirmesini sağlamasıdır.

Serebral vasküler endotel hücrelerini tam ortamda, T75 santimetre karelik bir doku kültürü şişesinde, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte% 80 birleşmeye kadar büyüttükten sonra, hücre kültürü ortamını atın ve hücreleri tripsin EDTA ile durulayın. Daha sonra şişeye bir ila iki mililitre taze tripsin EDTA ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede üç ila beş dakika ayırın. Hücrelerin ters çevrilmiş bir mikroskop altında kaldırıldığını doğruladıktan sonra, 10 mililitre taze tam hücre ortamının nazikçe eklenmesiyle reaksiyonu durdurun ve hücreleri santrifüjleme için 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Süpernatanı atın ve peleti başka bir santrifüjleme için 10 mililitre taze tam büyüme ortamında yıkayın. Daha sonra peleti, alt kültür için mililitre konsantrasyonda iki kez 10 ila beşinci hücrede tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Uygun sayıda alt kültürden sonra, oyuk başına 80 mikrolitre tam ortamda 1.6 kez 10 ila dördüncü hücreye, 96 oyuklu hücre dışı akı hücre kültürü plakasına tohumlayın ve plakayı% 5 karbondioksit içeren 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin.

Hücreler plakaya bağlandığında, ilgilenilen tedaviyi uygun kuyucuklara ekleyin ve hücreleri inkübatöre geri koyun. Mitokondriyal fonksiyonel değerlendirme testinden bir gün önce, 150 mikrolitre hücre dışı akı kalibrant çözeltisi ile hücre dışı akı sansör kartuşunu nemlendirin ve plakayı gece boyunca karbondioksit olmadan 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, hücre kültürü ortamını pH 7.0 hücre dışı akı tahlil ortamına dönüştürmek için plaka yıkama istasyonunu kullanın.

Ardından, hücreleri karbondioksit olmadan 37 santigrat derecede 30 ila 60 dakika inkübe edin. Hücreler dengelendiğinde, hidratlı kartuşu Biyoanalizöre yükleyin ve kalibrasyonu başlatmak için Başlat düğmesine tıklayın. Kalibrasyonun sonunda, kartuş alt plakasını çıkarmak ve hücre plakasını yüklemek için Kartuşun Kilidini Aç istemine tıklayın.

Ardından, elektronik tablo dosyasına aktarılmak üzere Biyoanalizörden hız değerlerini almak için veri dosyasını açın. Yanıtların kinetiğinin ve nispi yoğunluğunun farklı serebral vasküler endotel hücre tipleri arasında değiştiği göz önüne alındığında, bu deneylerde bir dizi bEnd konsantrasyonu vardır. Bir metabolik profil oluşturma testinde oksijen tüketim oranı seviyelerini ölçmek için en uygun hücre sayısını belirlemek için 3 hücre kullanıldı.

Gözlendiği gibi, bazal ve maksimal solunumlar ve yedek solunum kapasitesi, hücre yoğunluğuna orantılı bir yanıt göstermektedir. Bununla birlikte, ATP üretimi, kuyu başına en yüksek hücre konsantrasyonu kullanıldığında azalır, bu da aşırı birleşik bir hücre kültürünün deney için uygun olmadığını düşündürür. Optimal hücre yoğunlukları, kuyucuk başına hücre sayılarının orta aralığında ortaya çıkıyor gibi görünmektedir.

Bu nedenle, beklenen oksijen tüketim oranı seviyeleri, bu temsili deneyde orta aralıkta bir hücre konsantrasyonu kullanılarak değerlendirildi ve kodlamayan öncü mRNA moleküllerinin serebral vasküler endotel hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonu azalttığını gösterdi. Bu deneyler ayrıca, bazal solunum, ATP üretimi ve proton sızıntısı önemli bir değişiklik göstermese de, transfeksiyondan 24 saat sonra serebral vasküler endotel hücrelerinde bu moleküllerin aşırı ekspresyonu ile maksimal solunum ve yedek kapasitenin önemli ölçüde azaldığını göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik iki gün içinde tamamlanabilir.

Düzgün bir şekilde yapılırsa, hücrelerin kaplanmasından mitokondriyal fonksiyona erişmeye kadar. Bu prosedürü denerken, diğer prosedürlere başlamadan önce optimal hücre yoğunluğunu belirlemenin son derece önemli olduğunu hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, hücre canlılığının azalması veya diğer metabolik yollardaki değişiklikler nedeniyle mitokondriyal fonksiyonda meydana gelen değişiklikler hakkında ek soruları yanıtlamak için hücre canlılığı veya glikolitik tahliller gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, izole mitokondri içindeki sağlam hücreleri ve nörolojik hastalıklar, kanser veya metabolik bozukluklar dahil olmak üzere çeşitli hastalıkları kullanmak için mitokondriyal fonksiyon alanındaki araştırmacıların yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, serebral vasküler endotel hücrelerinde mitokondriyal fonksiyona nasıl erişileceğini iyi anlamış olmalısınız.