Tek Parçacıklar için mikroakışkan tabanlı Hidrodinamik Tuzak
21 Ocak 2011
Bu makalede, hidrodinamik akış dayalı parçacık hapsi mikroakışkan tabanlı bir yöntem mevcut. Biz böylece entegre bir microdevice keyfi parçacıkların hapsi ve mikromanipülasyon sağlayan bir geribildirim kontrol mekanizması kullanılarak bir sıvı durgunluk noktasında kararlı parçacık yakalama göstermektedir.
Bu yöntemin genel amacı, bir mikroakışkan cihazdaki laminer akış kullanılarak tekil mikro ve nano ölçekli parçacıkların hapsedilmesi ve manipüle edilmesidir. Hidrodinamik tuzak, mikrokanal birleşim noktasında bir durgunluk noktası akışına yol açan, çapraz yuva kanal geometrisine sahip bir mikroakışkan cihazdan oluşur. Akışkan akışını aktif olarak kontrol etmek ve parçacıkları hapsetmek için çıkış kanallarından birinde yer alan bir çip üstü valf kullanılır.
Parçacıklar, durgunluk noktası konumunun aktif kontrolü ile kullanıcı tarafından tanımlanan bir ayar noktasında hapsedilir. Parçacık konumunu takip etmek ve parçacık konumunu ayar noktasında tutmak için çip üzerindeki valfi düzenlemek amacıyla bir geri besleme denetleyicisi kullanılır. Hidrodinamik tuzak kullanılarak, seyreltik veya konsantre parçacık çözeltileri içindeki tekil parçacıklar yakalanabilir ve floresan veya parlak alan mikroskobu kullanılarak görüntüleri alınabilir.
Parçacık yörüngesinde ve parçacığın tuzak merkezinden yer değiştirme histogramında gösterildiği gibi, tek bir parçacık tuzak merkezinin bir mikronu içine hapsedilebilir. Merhaba, ben Illinois Üniversitesi'ndeki Kimya ve Biyomoleküler Mühendislik Bölümü ile Biyofizik ve Hesaplamalı Biyoloji Merkezi'nde, Profesör Charles Schroer'in laboratuvarından Eric Johnson Rio. Merhaba, benim adım Ari, Schroer Laboratuvarı'nda doktora sonrası araştırmacıyım.
Merhaba, ben Cheryl Schroeder ve bugün sizlere tekil partiküllerin hidrodinamik olarak yakalanması için bir mikroakışkan cihazın nasıl üretileceğini ve uygulanacağını göstereceğiz. Bu tekniğin, optik veya elektrokinetik tuzaklar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hidrodinamik yakalamanın yalnızca sıvı akışının etkisiyle gerçekleşmesi ve böylece nanoparçacık veya hücre yakalama için potansiyel olarak bozucu kuvvet alanlarının ortadan kaldırılmasıdır. Bu teknik, yakalanan partikülün kimyasal veya fiziksel özellikleri üzerinde herhangi bir gereksinim olmaksızın, mikro ve nano ölçekli partiküllerin serbest solüsyon ortamında yakalanmasına olanak tanıyarak temel ve uygulamalı bilimleri dönüştürme potansiyeline sahiptir.
Hadi başlayalım. Replikaların SU-8 kalıplardan daha kolay soyulmasını sağlamak için, birkaç damla trikloro(trifloroetil)silan içeren bir cam kabın bulunduğu vakumlu bir desikatöre waferları 10 dakika boyunca yerleştirerek SU-8 kalıpların yüzeyini silanize edin; akışkan ve kontrol katmanları için karıştırılmış DGAs PDMS kullanın. 15:1 oranındaki PDMS karışımını 750 RPM'de 30 saniye boyunca akışkan katman kalıbına spin coat yöntemiyle uygulayın ve ardından wafer'ı bir Petri kabına yerleştirin.
Benzer şekilde, kontrol katmanı kalıbını bir Petri kabına yerleştirin ve kalıbın üzerine beş bir oranında PDMS karışımını dört milimetre kalınlığa ulaşacak şekilde dökün. PDMS katmanlarını kısmen kürlemek için, gofretleri/PDMS'leri 70 °C'de 30 dakika boyunca pişirin ve oda sıcaklığına soğumalarını bekleyin. PDMS replikasını bistüri ile kesin ve SU-8 kalıbından soyarak çıkarın.
Ardından, 21 gauge iğne ile, çip üzerindeki membran valf görevini görecek olan mikrokanala erişim portu oluşturmak için PDMS üzerinde bir delik açın. Kontrol katmanlı PDMS replikasını, spin kaplama yöntemiyle PDMS akışkan katmanı uygulanmış wafer üzerine yerleştirin. Bir stereo mikroskop kullanarak kontrol katmanını akışkan katmanla dikkatlice hizalayın ve mühürleyin.
Katmanlar arasındaki tüm hava kabarcıklarının giderildiğinden emin olun ve oda sıcaklığına soğutulduktan sonra her iki katmanı tek bir monolitik PDMS blok haline getirmek için gece boyunca 70 °C'de pişirin; PDMS replikasını SU-8 kalıptan kesip ayırmak için bir skapel kullanın ve fazla PDMS'yi temizleyip her bir cihaz birimini ayırmak için bir jilet kullanın. Şimdi, akışkan katmanındaki mikro kanallara erişim portları açmak için 21 gauge bir iğne ile delikler açın. Bir lamı aseton ve IPA ile temizleyip nitrojen ile kurulayın.
Hem lamel hem de PDMS replika yüzeylerini 500 millitorr altında 30 saniye boyunca oksijen plazması ile işlemden geçirin. Ardından, geri dönüşü olmayan bir sızdırmazlık oluşturmak için iki yüzeyi derhal birbirine temas ettirin. Son olarak, PDMS katmanları ile lamel arasındaki bağlanmayı artırmak için cihazları gece boyunca fırınlayın.
İlk olarak, mikroakışkan düzeneği ters bir mikroskobun tablasına yerleştirin ve tabla klipsleriyle sabitleyin. Çözeltileri mikroakışkan düzeneğe iletmek için, bir mililitrelik ve 250 mikrolitrelik sızdırmaz şırıngaları sırasıyla tampon ve örnek çözeltileriyle doldurun. Örnek iletimini kontrol etmek için örnek şırıngası ile mikroakışkan düzendeki örnek portu arasında bir T valf kullanın.
Şimdi, perfluorooxy tüpler, luer lock adaptörler ve 24 gauge metal tüpler kullanarak şırıngalar ile mikroakışkan cihaz arasındaki akış bağlantılarını kurun. Ardından, mikroakışkan cihazdaki çıkış kanallarının akış bağlantılarını PFA tüpler ve 24 gauge metal tüplerle oluşturun. Şırıngalar ile çıkış kanalları arasında sabit bir basınç düşüşü sağlamak için, çıkışlar için kullanılan PFA tüpler eşit uzunlukta olmalı ve her ikisi de tampon çözelti ile doldurulmuş 1,5 mililitre'lik bir santrifüj tüpünün içine daldırılmalıdır.
Çalışma sırasında akışkan tabakaya hava sızmasını önlemek için, üç mililitrelik luer lock plastik şırınga kullanarak çip üzerindeki valfi florlu taşıyıcı yağ ile doldurun. Valf odasındaki havayı PDMS membran aracılığıyla akışkan tabakadaki mikrokanala itin.
Çip üzerindeki valf işlemleri için. Basınçlandırılmış inert gaz kaynağını kontrol katmanındaki porta bağlayın. Çıkış kanalları da dahil olmak üzere sistemdeki tüm hava kabarcıklarının giderildiğinden emin olmak için akışkan bağlantılarını ve mikroakışkan aygıtı 0.5 milliliters tampon çözelti ile durulayın.
Hava kabarcıklarını temizlemek için kullanılan tipik akış hızları 2000 ile 5, 000 µL/saat arasında değişir; hava kabarcıkları mikroakışkan kanallardan temizlendikten sonra, partikül yakalama için tipik bir volumetrik akış hızı olan 50 ile 100 µL/saat değerine akış hızını düşürün. Şimdi, numunenin mikroakışkan cihaza akmasına izin vermek için T valfini değiştirin. Lineer geri besleme kontrol algoritması uygulayarak partikül yakalamayı otomatize eden özel yapım LabVIEW kodunu çalıştırın.
Kod, bir CCD kameradan görüntüler yakalar ve çip üzerindeki bir pnömatik valfin konumunu aktif olarak modüle eden bir basınç regülatörüne elektrik potansiyeli iletir. Mikroskop XY taşıma tablasını kullanarak, tuzaklama bölgesini kamera görüşünün merkezine konumlandırın. Tuzaklama bölgesini objektif lensin odağına getirin ve görüntüleme koşullarını optimize etmek için kamera ayarlarını düzenleyin.
ROI merkezinin tuzak merkezinin konumu olacak şekilde, kameranın görüş alanı içinde dikdörtgen bir ilgi alanı seçin. Şimdi, yonga üzerindeki valfe uygulanan ofset basıncını başlatın. Karşı çıkış kanalında yer alan 100 ila 200 mikron genişliğinde bir daralma.
Yonga üzerindeki valfin çalışması için bir ofset basıncı sağlar. Geri besleme denetleyicisini başlatın ve tuzak yanıtını optimize etmek için oransal kazancı ayarlayın. Akış hızına ve yonga üzerindeki valfin konumuna bağlı olarak, tuzak stabilitesini artıran ve istenmeyen partikül osilasyonlarını ortadan kaldıran optimal bir oransal kazanç değeri vardır.
LabView kodu, tuzaklama bölgesine giren parçacıklardan birini otomatik olarak yakalayacaktır. Bu videoda, giriş yönündeki parçacık hareketi, giriş yönündeki hapsetme sıkılığını maksimize etmek için numune giriş akışının açık bırakılmasından kaynaklanmaktadır. Kullanıcı, yakalama sırasında numune akışını kapatarak akışın çapraz kanal eklemine eşit şekilde dağılmasını sağlayabilir, yakalanan parçacığı izleyebilir ve manuel odaklama veya otomatik odaklama özellikli bir mikroskop düzeneği kullanarak parçacık odağını görüntü düzleminde koruyabilir.
Entegre mikroakışkan cihaz; bir numune odaklama ünitesi, bir haç slot eklemi ve bir pnömatik valften oluşur; yakalama işlemi haç slot ekleminde gerçekleşir ve partikül konumu, pnömatik valf aracılığıyla mikrokanal eklemindeki akış alanının aktif olarak ayarlanmasıyla kontrol edilir. Burada, tek bir boncuğun hidrodinamik tuzağa hapsedilmiş bir görüntüsü yer almaktadır. Tuzak merkezindekine ek olarak, haç slot eklemindeki yakalama bölgesinde yakalanmamış birkaç boncuk da gösterilmiştir.
Hapsedilmiş 2,2 mikronluk floresan polistiren bir boncuğun yörüngesi haritalanır. Parçacık başlangıçta üç dakika boyunca hapsedilir. Ardından tuzaktan serbest bırakılır ve çıkış kanallarından biri boyunca uzaklaşır.
Hapsedilmiş bir boncuğun, çıkış kanalları yönündeki tuzak merkezinden olan yer değiştirme histogramı, partikülün tuzak merkezinden bir mikron mesafede sınırlandırıldığını göstermektedir. Bugün, bir mikroakışkan cihaz içinde oluşturulan stagnasyon noktası akışını kullanarak mikro ve nano ölçekli partiküllerin serbest çözelti içinde hapsedilmesi için bir yöntem olarak EM tuzağı sunduk. Hidrodinamik hapsetme, alternatif kuvvet alanı tabanlı hapsetme yöntemleri ile gerçekleştirilmesi zor olan konsantre partikül süspansiyonlarında tek bir hedef partikülün sınırlandırılmasını sağlar.
Daha fazla geliştirilmesinin ardından, bu yeni teknik biyofizik, hücre mekaniği, akışkanlar dinamiği, enzimoloji ve sistem biyolojisi alanlarında bilimsel araştırmalara olanak sağlayacaktır. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, bu tekniğin deneyleriniz için yararlı olacağını umuyoruz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, hidrodinamik akış kullanarak mikro ve nano ölçekli parçacıkların hapsedilmesi ve manipülasyonu için mikroakışkan tabanlı bir yöntem sunmaktadır. Bir mikro cihaz içindeki akış durma noktasında kararlı parçacık hapsetme sağlamak için bir geri beslemeli kontrol mekanizması uygulanmıştır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikroakışkanlar
- Parçacık manipülasyonu
- Hidrodinamik yakalama
Arka Plan
- Mikroakışkan cihazlar, sıvı akışının hassas kontrolünü sağlar.
- Hidrodinamik tuzaklar, partikülleri belirli konumlarda hapsedebilir.
- Aktif kontrol mekanizmaları, partikül manipülasyon yeteneklerini artırır.
- Partiküllerin görüntülenmesi için floresans ve parlak alan mikroskobu kullanılabilir.
Çalışmanın Amacı
- Mikroakışkan cihazlarda tekil parçacıkları hapsetmek için bir yöntem geliştirmek.
- Etkili parçacık hapsedilmesi için laminer akışı kullanmak.
- Parçacık konumunu korumak için geri bildirim kontrolü uygulamak.
Kullanılan Yöntemler
- Çapraz yarık kanal geometrisine sahip mikroakışkan cihaz.
- Sıvı akışının aktif kontrolü için çip üzeri valf.
- Parçacık konumunu izlemek ve düzenlemek için geri besleme denetleyicisi.
- Floresan ve parlak alan mikroskopisi gibi görüntüleme teknikleri.
Temel Sonuçlar
- Hem seyreltik hem de konsantre çözeltilerde tekil partiküllerin başarıyla yakalanması.
- Kullanıcı tarafından tanımlanan bir ayar noktasında partikül hapsinin kanıtlanmış kararlılığı.
- Geri besleme kontrolü kullanılarak durgunluk noktası konumunun etkili bir şekilde düzenlenmesi.
- Mikroskopi teknikleri kullanılarak yakalanan partiküllerin görüntülenme yeteneği.
Sonuçlar
- Bu yöntem, mikroakışkan sistemlerde partikül manipülasyonu için sağlam bir yaklaşım sunmaktadır.
- Aktif kontrol mekanizmaları, partikül yakalama hassasiyetini artırır.
- Bu teknik, partikül hapsetme gerektiren çeşitli alanlara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik
Bu mikroakışkan hidrodinamik tuzak, karmaşık biyolojik süspansiyonlardaki tekil mikro ve nano ölçekli partiküllerin yüzey sabitlemesi veya perturbatif alanlar gerektirmeden, doğrudan partikül davranışının gözlemlenmesine olanak tanıyarak erken aşama hedef doğrulamasını destekleyen, etiketsiz ve alansız bir hapsetme sağlar. Yöntem, keşif iş akışlarında nanopartikül-biyomolekül etkileşimlerinin mekanistik risklerinin azaltılması için kantitatif uzamsal kontrol ve uzun süreli stabilite sunar. Konsantre örneklerle ve rastgele partikül türleriyle olan uyumluluğu, ilaç taşıyıcı araçların ve hücre dışı veziküllerin preklinik taramaları için translasyonel ilgiyi artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Optik, manyetik veya elektrik alanı artefaktları olmaksızın doğal durumdaki etkileşimleri gözlemlemek için tekil partiküllerin serbest çözeltide yakalanmasını sağlayarak terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Geleneksel yakalama yöntemlerinin arka plan girişimleri nedeniyle başarısız olduğu serum veya hücre lizatları gibi kalabalık ortamlarda fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Öngörücü Değer: Fizyolojik koşullara yakın şartlarda bağlanma kinetiğini ve stabilitesini değerlendirmek için partikül dinamiğinin uzun süreli gözlemlenmesine izin vererek öncü bileşiklerin tanımlanmasını kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Heterojen popülasyonlardan tekil varlıkların izole edilmesini ve manipüle edilmesini sağlayarak, sonraki iş akışları için valide edilmiş partikül sistemleri hazırlar.
- Kantitatif Çıktı: Farklı koşullar arasında partikül davranışlarını karşılaştırmak için tekrarlanabilir metrikler olarak hizmet eden yer değiştirme histogramları ve yörünge verileri oluşturur.
- Platform Ölçeklenebilirliği: Çip üzeri pnömatik valfler aracılığıyla mevcut mikroakışkan cihazlarla entegre olur; bu sayede birden fazla hedef üzerinde yeniden kullanıma olanak tanır ve tarama basamaklarındaki verimliliği artırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: Yüzey kimyasını değiştirmeden partikülleri biyolojik olarak ilgili matrislerde hapsederek, keşiften preklinik doğrulamaya kadar sürekliliği sağlar.
- Riskle Ayarlanmış İlerleme: Karmaşık sıvılarda kolloidal bütünlüğün bir göstergesi olarak hapsetme stabilitesini nicelleştirerek, nanopartikül formülasyonlarının mekanik olarak riskten arındırılmasını sağlar.
- Biyobelirteç Uyumu: Seyreltilmemiş biyosıvılarda tekil ekstrasellüler veziküllerin veya lipid nanopartiküllerin uzun süreli gözlemlenmesine izin vererek translasyonel biyobelirteç çalışmalarını destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulamadan öncü bileşik belirlemeye ve preklinik değerlendirmeye kadar uzanan keşif sürecine, özellikle doğal ortamlarda bozulmamış partikül analizi gerektiren çalışmalar için uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Etiketleme veya yüzeyle bağlama gerekmeksizin, çözeltideki tek parçacık etkileşimlerinin doğrudan görselleştirilmesini sağlayarak hipotez testlerini ve yolak aydınlatılmasını destekler.
- Tarama: Çalışmalar boyunca tutarlı yakalama koşullarını koruyan aktif akış kontrolü aracılığıyla analiz tekrarlanabilirliğini artırır ve parçacık tabanlı analizlerdeki değişkenliği azaltır.
- Analitik: Farklı tampon veya ligand koşulları altındaki parçacık yanıtlarını karşılaştırmak için kantitatif okumalar olarak sentroit takibi ve yer değiştirme ölçümleri sağlar.
- Translasyonel Araştırma: in vivo koşulları taklit eden konsantre biyolojik sıvılarda parçacık davranışının değerlendirilmesine olanak tanıyarak preklinik çalışmalarla bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli mikroakışkan platformlara entegre edilebilen modüler bir yakalama modülü olarak işlev görür ve projeler arası yeniden geliştirme maliyetlerini düşürür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Alan kaynaklı artefaktları ortadan kaldırarak ve süspansiyon halindeki doğal partikül durumlarının gözlemlenmesine olanak tanıyarak öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Geri besleme kontrollü durgunluk noktası konumlandırması yoluyla standartlaşma ve tekrarlanabilirlik sağlayarak farklı kullanıcılar ve oturumlar arasında tutarlı tuzak performansı sunar.
- Stratejik Değer: Gerçekçi matrislerdeki partikül stabilitesi ve etkileşim eğilimi hakkında erken, kantitatif veriler sağlayarak karar verme süreçlerini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Karmaşık sıvılarda tek partikül yakalama stabilitesine dayanarak nanopartikül veya vezikül adaylarının risk ayarlı önceliklendirmesini mümkün kılar.
Uygulama Hususları
- Mikroakışkan üretimi, floresan mikroskobu ve LabVIEW tabanlı görüntü işleme ve basınç regülasyonu gibi geri besleme kontrol sistemlerinde uzmanlık gerektirir.
- Gerçek zamanlı partikül takibi ve akış ayarı için pnömatik basınç regülatörlerine, çip üzeri valflere ve yüksek hızlı görüntüleme altyapısına bağımlıdır.
- Laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği sağlamak için valf kalibrasyon protokollerinin ve partikül takip parametrelerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Uzama akışı altında yakalama verimliliği şekle ve boyuta göre değişebileceğinden, küresel olmayan veya deforme olabilir partiküllere uygulandığında adaptasyon değerlendirmeleri içerir.
- Güvenilir takip için partikül floresansı veya kontrastı ihtiyacı ile uzun süreli çalışmalarda periyodik yeniden kalibrasyon gerektiren potansiyel kaymalar gibi pratik kısıtlamalar içerir.
