Hücre Yakalama mikroakışkan Cihaz Kullanımı

Hazırladığımız cihazlar, 10'lu veya 20'li kitler halinde paketlenmiş durumdadır; ulaştıklarında, soğuk zincirle bir kutu içerisinde gönderilirler ve kit, deneyi gerçekleştirmek için ihtiyacınız olan tüm bileşenleri içerir. Kit içerisindeki deney malzemeleri, oda sıcaklığında kalabilen tüm şırıngaları ve tampon çözeltileri içeren bir pakettir. Ayrıca bu deneyde takip edeceğimiz protokolün bir kopyası da bulunmaktadır.

Ayrıca, asıl cihazları ve soğutulması gereken tüm çalışma tamponlarını içeren soğutmalı bir kutu bulunmaktadır. Kitler genellikle 10'lu veya 20'li gruplar halinde paketlenir. Kitler kullanılmadığında soğutulmalıdır.

Her bir şırınga ve her bir kit bileşeni dikkatlice etiketlenmiştir ve etiketler, takip ettiğimiz protokoldeki tabloyla uyumludur. Böylece, münferit adımlarda hangi şırınganın veya kit bileşeninin kullanılması gerektiği konusunda herhangi bir belirsizlik oluşmaz. Cihazların paketleri açılıp biyolojik güvenlik kabinine yerleştirildikten sonra, nötrofillerin izole edilmesi ve sonraki genomik uygulamalar için lize edilmesi işlemini gerçekleştireceğiz; çünkü elde edeceğimiz hücre lizatı, RNA izolasyonu için veya hücre lizatından RNA ekstraksiyonu yapmak için kullanılacaktır.

Bu nedenle, çalışma alanımızın sadece steril anlamda değil, aynı zamanda çevrede tipik olarak bulunan tüm RNA'lardan da arındırılmış olduğundan emin olmak istiyoruz. Bu yüzden, tüm alanınızı ve cihazlarınızı RNA'ları yok eden bir solüsyonla silmeniz çok önemlidir. Genellikle tüm aletlerimizi ve çalışma yüzeylerimizi, birçok üreticiden temin edebileceğiniz RNA SAP veya RNAs away ile siliyoruz.

Cihaz, ısı ile mühürlenmiş bir poşet içerisinde paketlenmiştir. Her cihaz mühürlüdür ve üzerinde bir barkod bulunur. Klinik örneklerle çalışıyorsanız, bu barkodu not etmelisiniz.

Böylece cihazın mührü açılır, kapağı çıkarılır ve pompa tutucu manifold cihazına yerleştirilir. Kullandığımız kan örneği, tam kan örneğidir. Bunu standart 1 ml BD şırınga aracılığıyla akıtabiliriz ve bu şırınga birinci şırınga olarak etiketlenmiştir.

Genellikle yapılan işlem şudur: şırınga paketten çıkarılır ve kan tüpünün kapağı dikkatlice açılır. Ardından 700 µL veya 0,7 mL kan damlatılır ve bunun yarısı, yani 350 µL, 1,5 mL'lik bir tüpe enjekte edilir. Teşekkürler. Bu sayede kanınız ileri işlemler için iletilebilir.

Kan tüpünüz iletilebilir ve böylece cihaz arızası durumunda elinizde hala yedek kan kalmış olur. Şimdi yapacağımız işlem, içinde kan bulunan şırıngayı, bu cihazla birlikte bir tüp parçasına bağlı olan bu iğneye yerleştirmek olacak. Mikroakışkan izolasyon cihazı ile çalışırken çok dikkatli olmalıyız.

Cihazın içine hava kabarcığı girmemesi konusunda çok dikkatli olmalıyız, aksi takdirde cihaz düzgün çalışmayacaktır. Bu nedenle genellikle yaptığımız işlem; şırıngayı alıp pistonu aşağı iterek sıvıyı cihazın üst yüzeyine eklemek ve tüm sıvıyı boşaltmadan önce yüzeyin tamamen ıslandığından emin olmaktır. Dururuz ve şırınga gövdesini iğneden dikkatlice çıkarırız; böylece iğne ucunu veya iğnenin luer konnektörünü, şırıngada kalan tampon çözelti ile doldurmuş oluruz.

Bunu atıyoruz. Ardından kan dolu şırıngamızı alıp bu Luer hub'a yerleştireceğiz. Kanı dökmemeye ve herhangi bir hava kabarcığı girmemesine dikkat ediyoruz.

Herhangi bir kan sızıntısı ihtimaline karşı, şırınganın gövdesini ve tüpü tutan bir kelepçe kullanmak en iyisidir. Şırınga, tüp yuvasına veya iğneye bağlandıktan sonra, konnektörde bulunabilecek hava kabarcıklarını gidermek için şırıngaya birkaç kez hafifçe vurulur. Ardından bu şırınga, şırınga pompasına yerleştirilir ve kilitleme vidası ile sabitlenir.

Şırınga pompası açılır ve akış koşullarımız önceden ayarlanmıştır. Bu kanı cihazdan dakikada 30 µL hızla akıtacağız. Şırınga gövdesi şırınga pompasına yerleştirildikten sonra, hareketli piston kolundaki düğmeye basacağız ve kol, pistonun üst kısmına değene ve sıvıyı ucundan dışarı itmeye başlayana kadar aşağı doğru kaydıracağız.

Bu, küt uçlu, paslanmaz çelik bir iğnedir. Sistemin hazırlandığından emin olduğumuzda, çalıştırma düğmesine basacağız. Kan akışını başlatmak için, akışı durdurmak amacıyla durdurma düğmesine basarsınız ve ardından temiz bir 1.5 ml santrifüj tüpü veya fendor tüpü alarak dikkatlice bağlantıyı kesersiniz.

Sadece birini çıkarın, cihazın bir portundan tüpü sökün. Bu tüp söküldüğünde, onu 1.5 mil fendor tüpüne yerleştireceğiz. Kan akışını yeniden başlatmak için çalıştır düğmesine basacağız.

Bir damla kan oluştuğunu gördüğümüzde, pompayı durdururuz ve kanı cihazda yeni açtığımız girişe yerleştiririz. Kan akışını başlatmak için "çalıştır" düğmesine basarız ve beş dakikalık bir zamanlayıcı kurarız. Kanın tüm odacıkları eşit şekilde doldurduğundan ve cihazda belirgin hava kabarcıkları olmadığından emin olmak istiyoruz.

Herhangi bir hazneye giden akışı engelleyen hava kabarcıkları varsa, bir cımbız yardımıyla yakalama haznelerine çıkan küçük kanallar veya yakalama haznelerinden çıkan küçük kanallar boyunca işlem yapabilirsiniz. Cihaz düzgün bir şekilde doluyor, bu nedenle beş dakika sonra, kan akışını durdurmak için şırınga pompasındaki durdurma düğmesine basın, şırınga klembini gevşetin ve şırıngayı pompa tutucusundan çıkarın. Ardından, nükleaz içermeyen PBS yüklü üç numaralı şırıngayı kullanacağız; temel olarak, hava kabarcıklarını önlemek için cihaz yüzeyinin ıslak olduğundan tekrar emin olacağız ve şırıngaya hafifçe vurarak tüm hava kabarcıklarının şırınga gövdesinin üst kısmında olduğundan emin olacağız.

Şırınga pompasındaki kolu gevşetin ve üç mililitrelik şırıngayı pompaya yerleştirin. Kolu sıkın ve ardından piston, şırınganın pistonuna temas edene kadar aşağı bastırın. Çalıştır düğmesine basıyoruz ve cihazın sıvıyla doldurulmasını bekliyoruz; paslanmaz çelik iğnenin ucunda bir damlacık görmeyi bekliyoruz.

Bir damlanın oluştuğunu gördüğünüzde pompayı durdurursunuz. Kan içeren paslanmaz çelik ucu çıkaracağız. Ardından yıkama tamponunu yerleştirip çalıştırma düğmesine basacağız.

Bunu beş dakika boyunca çalıştıracağız. Temiz bir bez alarak giriş veya çıkışta bulunabilecek az miktardaki kanı silmelisiniz. Cihazdan beş dakika boyunca yıkama tamponu geçirildikten sonra, cihazdaki tüm kan tamamen temizlenmiş olmalıdır; bunu, cihazda hiç kırmızı kan kalmadığında ve cihaz şeffaf göründüğünde anlayabilirsiniz. Bu nedenle, beş dakikanın sonunda yıkama tamponunun akışını durduracağız.

Ardından, şırıngayı şırınga pompasından çıkaracağız. Esnek çıkış borusunun hemen üzerindeki 1,5 ml'lik mikro santrifüj tüpünü kapatacağız. Daha sonra, atık borusunu cihazdan çekerek mikro santrifüj tüpünü dikkatlice yukarı kaldıracağız.

Bunu biyotehlike konteynerine atacağız. Kitin içinde, aslında Teflon'dan yapılmış yeni bir çıkış hortumu bulunmaktadır. Bunun üzerinde yine paslanmaz çelik bir uç vardır.

Eski çıkış tüpünü bu yeni çıkış tüpüyle değiştireceğiz. Çıkış tüpünü alıp yaklaşık olarak U veya V şeklinde bükmeye çalışacağız. Ayrıca kit ile birlikte bir kaya parçalayıcı kolon da gelmektedir; bu kolon DNA'yı keser ve temel olarak hücre lizatınızı homojenleştirir.

Şredder kolonunun mor kapağını açacağız ve çıkış borusunu Kay Shredder kolonuna yerleştireceğiz. Kit içerisinden, üzerinde RLT için olduğu belirtilen iki numaralı şırıngayı alacağız. Bu, 22 gauge küt uçlu, paslanmaz çelikten standart bir BD 1 mL şırıngadır.

Cihaza Kyogen marka 350 µL standart RLT enjekte etmek için bunu kullanacağız. Cihazın yaklaşık 50 µL'lik bir ölü hacmi olduğu için, RLT'yi enjekte ederken arkasından bir hava kabarcığı enjekte ederek cihazdaki bu ölü hacmin chi parçalayıcı kolona boşalmasını sağlamak istiyoruz. Bunu gerçekleştirmek için şırıngamıza önce 350 µL hava, ardından 350 µL veya 0,35 mL RLT çekeceğiz; böylece RLT şırınganın alt kısmında yer alacaktır.

Şırıngayı ters çevirip havayı enjekte etme isteğine karşı koyun. Buradaki hava, tüm RLT'nin Kay parçalayıcı kolonuna girdiğinden emin olmak içindir. Yıkama tamponundan gelen tüpü çıkaracağız.

RLT içeren şırıngamızı yerleştireceğiz ve RLT'yi yaklaşık 30 saniyelik bir süre boyunca yavaşça cihaza enjekte edeceğiz; bu sırada çıkış borusunun atıkları chi shredder kolonuna boşalttığından emin olacağız. Cihaza hava girmeye başladığında, pistonu aşağı doğru iteceğiz ve tüm sıvının Kay Shredder kolonuna boşalmasını bekleyeceğiz. Kay shredder kolonunu çıkaracağız ve dengelenmiş bir mikrocentrifuge cihazında 15.000 RPM hızda veya bir masaüstü mikrocentrifuge cihazında maksimum RPM hızda iki dakika boyunca santrifüjleyeceğiz.

Kolonu iki dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, şu an RLT içinde olan örneği kolondan çıkaracağız ve sağlanan mor kapaklı kriyoviyallerden birine yerleştireceğiz. Klinik bir örnekle çalışıyorsanız, bu kriyoviyalleri deneyin başında etiketlemiş olacaksınız. İşte kriyoviyal içerisindeki lizat.

Bu kriyoviyul hemen -80 °C bir dondurucuya yerleştirilir ve sevkiyat veya daha sonraki RNA ekstraksiyonu için saklanır. Bu, nötrofillerin izolasyonu için alternatif bir protokoldür. Hücreleri RLT tamponu ile liz etmek yerine, onları standart bir histolojik boya ile boyayacağız.

Bir boyama. Bu nedenle, sızdırmaz cihazı torbadan çıkarıp tekrar paketini açıyoruz, cihaz üzerindeki lot numarasını not ediyoruz ve Petri kabını Petri kabı tutucusuna yerleştiriyoruz.

Bir mililitrelik şırıngayı paketinden çıkaracağız (bir numaralı şırınga), içine 700 µL kan yükleyeceğiz ve bunun yarısını, yani 350 µL'sini bir eend DPH tüpüne enjekte edeceğiz. Bunu kenara ayıracağız. Ardından, içine enjeksiyon yapmak için kullanacağımız tüplerin bulunduğu dört numaralı şırıngayı alarak kanı cihaza enjekte edeceğiz.

İğnenin tabanını, tüpün ucundan kimyasal bir yöntemle tutacağım. Şırınga gövdesini çıkarın ve lümenle doldurun. Adaptör, bu şırıngayı tamponlayacak ve imha edecektir.

Olası sızıntıları toplamak için kimyasal temizleme bezi kullanarak, kan içeren şırıngayı iğneye yerleştireceğiz. İğne ile şırınga gövdesi arasındaki bağlantı noktasında bulunan hava kabarcıklarını gidermek için şırıngaya hafifçe vuracağız. Şırıngayı şırınga pompasına yerleştireceğiz ve şırınga pompasının hareketli koluna bastırarak tüpleri hazırlayacağız.

Cihazın, yani yakalama cihazının çıkışlarından birindeki boruyu söküp 1,5 ml'lik bir eppendorf tüpüne yerleştireceğiz. Ardından şırınga pompasında çalıştır düğmesine basarak kan akışını başlatacağız. Paslanmaz çelik uçta bir kan damlası oluşmasını bekleyeceğiz.

Damlacık oluştuktan sonra durdurun, kanı temizleyin, cihazın içine yerleştirin ve çalıştırın. Şimdi beş dakikalık bir zamanlayıcı ayarlıyoruz. Tamam, beş dakika boyunca cihazdan akış gerçekleştikten sonra, şırınga pompasındaki durdurma düğmesine basın ve şırıngayı serbest bırakın.

Ardından, bu şırıngayı 1X PBS olan yıkama tamponu içeren 3 mL'lik şırınga ile değiştireceğiz. Cihazın üst kısmının sızdırmaz olduğundan tekrar emin olalım ve ardından kan veya plazma içeren iğne ucunu çıkaralım. Cihazı hazırlama işlemine başlayın.

Damlacık formlarını oluşturacağız, bunları cihaza yerleştirip çalıştırma düğmesine basacağız; giriş veya çıkış borularındaki kan kalıntılarını sileceğiz ve yıkama adımından sonra bunun beş dakika boyunca akmasına izin vereceğiz. Tekrar, şırınga pompasını durduracağız ve şırıngayı pompa tutucusundan çıkaracağız. Standart GIM sürdürme işlemi için önce hücreleri sabitleyeceğiz ve %100 methanol kullanarak onları susuzlaştıracağız.

Elimizde metanol ile önceden doldurulmuş 3 mL'lik bir şırınga var. Şırıngayı tekrar hazırlayacağız, metanolün aktığından emin olacağız, şırınga pompasını durduracağız, cihazın içine yerleştireceğiz ve çalıştırma düğmesine basacağız. Örnekleri bu metanol çözeltisinde iki ila dört dakika boyunca sabitleyeceğiz.

Böylece iki ila dört dakikalık tespit ve metanol işleminden sonra pompayı durdururuz, şırıngayı metanol ile boşaltırız ve burada, deiyonize su ile bire beş oranında seyreltilmiş Sigma marka eem sustain standart eem sustain içeren üç ml'lik bir şırıngayı dolduracağız. Seyreltme işleminin ardından, çözeltiyi şırıngaya yükledik ve cihazı tıkayabilecek partikülleri süzmek için şırınganın ucuna 0,8 mikronluk bir filtre taktık. Beş ila 10 dakika boyunca boyama yapılır.

Ardından deiyonize su ile durulama yapacağız. Böylece 5 ila 10 dakikalık boyama işleminden sonra şırınga pompasını durduracağız ve boyama tamponu içeren şırıngayı, deiyonize su içeren şırınga ile değiştireceğiz; temel olarak, cihazdan SAI'nin mavi renginin temizlendiğini görene kadar yıkama yapacağız. Fazla gim sustain cihazdan durulandıktan sonra yıkama çözeltisini durdururuz.

Ardından, su şırıngasını girişteki yerinden çıkaracağız. Sonra cihazın çıkış borusunu alacağız. Bu boruyu uç kısmından cımbızla kavrayacağız.

Bu, esnek bir tigon hortumdur ve bunu cihazın girişine geri yerleştireceğiz. Bu işlem cihazı sızdırmaz hale getirerek hücrelerin hidrate kalmasını ve morfolojilerinin korunmasını sağlar. Şimdi meslektaşım Dr. John Hong Chang, CD4 pozitif lenfositlerin izolasyonu için alternatif bir protokolü ve ardından doğrudan mikroakışkan cihaz içinde gerçekleştirilen immunofloresan boyamayı gösterecektir.

Benim adım Shong Hong ve bugün size mikroakışkan cihazda hücre boyamayı demonstre edeceğim. Bu aşamada, işlenmemiş tam kandan spesifik olarak kan hücrelerini izole etmek için bir mikroakışkan immünoafinite izolasyon cihazının nasıl kullanılacağını zaten göstermiştim. Bu amaçla, bazıları hücreleri lizle ve izole edilen bu hücrelerden protein ve DNA içeriği elde etmek isterler. Benim araştırmam için ise, hücreleri elde etmek ve ardından hücre sayımı yapmakla ilgileniyorum; örneğin, tam kandan CD4 hücre sayısını elde etmek ve bunu tanısal amaçlar için bir gösterge olarak kullanmak istiyorum.

Kullanılan cihaz Ken'in cihazına çok benzerdir. PDMS'ten yapılmış düz bir odacık şeklinde tasarlanmıştır. Geometri biraz farklı olduğu için operasyon parametreleri de biraz farklılık göstermektedir; ancak genel operasyon prosedürü genel hatlarıyla oldukça benzerdir.

Bu nedenle, hücre yakalama ve durulama adımlarının tamamını atlayarak doğrudan hücre sayım prosedürlerindeki hücre boyama adımına geçeceğim. Burada, tam kandan hücrelerin yarısının halihazırda yakalandığı ve cihazın PBS ile durulandığı bir cihazım var. Böylece, istenmeyen hücreler cihazdan yıkanarak uzaklaştırıldı ve ben de önceden, cihazda izole edilen hücreleri işaretlemek için kullanılan özel bir antikor karışımı hazırladım.

Burada kullandığımız antikor konsantrasyonu, hücrelerin floresan mikroskop altında çok yüksek floresan yoğunluğuyla boyanması için optimize edilmiştir. İşlem oldukça basittir. Antikor çözeltisiyle doldurulmuş şırıngayı şırınga pompasına yerleştiriyoruz ve ardından akış hızının ihtiyacımız olan doğru parametrelere ayarlandığından emin oluyoruz.

Ardından şırınga pompasını çalıştıracağız, borunun ucunu izleyerek solüsyonun akmaya başladığından ve boruda artık hava kabarcığı kalmadığından emin olacağız. Daha sonra boruyu, hücrelerin yakalandığı mikroakışkan cihaza bağlayabiliriz. Böylece, cihaz içerisinde izole ettiğimiz hücreleri boyamak için antikor cihazın içine akmaya başlar; burada akış hızını dakika başına beş mikrolitre (5 µL/min) olarak kullanıyorum, ancak cihaz geometrisine bağlı olarak kendi amacınız için kullanmak isteyeceğiniz farklı akış parametreleri olabilir.

Ardından, mikrokanal içindeki tüm solüsyonu değiştirmeye yetecek hacimde olması için antikor solüsyonunu beş dakika boyunca akıtmaya devam edeceğiz. Antikor enjeksiyonundan sonra akışı durduracağız. Özetle, mikrokanal içindeki tüm solüsyonu değiştirmek için antikoru beş dakika boyunca 5 µL/dk hızında akıtacağız.

Ardından akışı durdururuz ve cihazın oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe olmasını sağlarız. Hücreler boyama antikoruyla inkübe edilirken floresan antikorlar sönümlenebileceği için bu işlem karanlıkta yapılmalıdır. Genellikle 15 ila 30 dakikalık boyamadan sonra, tüpleri cihazdan çıkarırız ve cihazdaki bağlanmamış antikorları yıkamak için antikor şırıngasını bir tampon şırıngasıyla değiştiririz.

Buradaki yıkama solüsyonu, PBS solüsyonu içinde %1 BSA içermektedir. BSA, antikorun yüzeye bağlanmasını engellemek için kullanılır ve biz de aynısını yapacağız. Öncelikle, istediğimiz doğru akış hızini sağladığımızdan emin olmak için şırınga pompasındaki akış hızını ayarlarız ve ardından, cihazla bağlantısını kurmadan önce şırınga pompasını başlatarak tüpten gerçekten sıvı geldiğinden emin oluruz.

Bunun amacı, tüp içerisinde kalıntı şeklinde hava kabarcığı kalmamasını sağlamaktır. Böylece enjeksiyon yapıldığında cihazımıza hava kabarcığı girmez. Ardından tüpü cihaza takarız ve cihazdaki tüm yıkanmış, bağlanmamış antikorların yerini değiştirmek için beş dakika daha akışa bırakırız.

Yıkama adımının ardından, hücreleri %1 PFA ile sabitleyeceğiz. Bunu yapmanın amacı, eğer görüntüleme hemen gerçekleştirilemiyorsa, cihazın birkaç haftaya kadar saklanabilmesini sağlamaktır. Dolayısıyla prosedür oldukça basit ve anlaşılırdır.

Bu işlem, daha önce yaptıklarımıza benzerdir. Şırıngayı pompaya yerleştiririz, akış hızını istediğimiz değere ayarlarız ve ardından şırınga pompasını başlatıp, hücreleri sabitlemek için fiksatif olan paraform IDE çözeltisini cihazımıza enjekte etmek üzere boruyu cihazımıza bağlarız. Yine, yaklaşık beş dakika boyunca akışa bırakırız.

Böylece PFA, cihazdaki tüm hücreleri sabitlemek için cihazdaki tüm tamponu değiştirir. PFA ile sabitleme adımından sonra, sadece PFA şırıngasını çıkarırız ve artık cihaz görüntüleme için hazırdır. Bazı durumlarda, araştırmacılar hücre yüzey markörü boyamasıyla üst üste bindirmek için bir çekirdek boyaması yapmak isteyebilirler.

Bu amaçla, işlem sonunda DPI kullanarak çekirdek boyaması yapacağız. DPI şırıngasını yerleştirip şırınga pompasını çalıştırıyoruz ve DPI'ın cihazımızdan akışını sağlıyoruz. Böylece hücrelerin konumunu göstermek için hücrelerdeki çekirdekler boyanacaktır.

Ve böylece, DPI boyama görüntüsü daha sonra hücrelerin nerede olduğunu göstermek için yüzey belirteci boyamasıyla üst üste bindirilebilir. Bu nedenle, DPI boyamasının sonunda, bağlı olmayan DPI'ı tampon çözelti ile tekrar yıkamamız gerekir. Dolayısıyla, bağlı olmayan DPI'ı yıkamak için yine %1 BSA içeren PBS kullanıyoruz.

İşlem, daha önce yaptığımızla benzerdir. Tampon şırıngasını cihazımıza takıyoruz ve bağlanmamış DAP'ı temizlemek için cihazın içine tampon akışını sağlıyoruz. Mikroakışkan cihazda hücrelerin boyama işleminin tamamı bu şekildedir.

Tüm boyama prosedürlerinin ardından cihazlar görüntüleme için hazırdır. PFA ile tespit işlemi yaptığımız için, görüntüleme hemen gerçekleştirilemezse cihazlar birkaç hafta boyunca saklanabilir.