HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Bu prosedürün genel amacı, hastanın kan plazmasından HIV RNA ekstraksiyonu yaparak viral zarf geninin V3 bölgesini dizilemek suretiyle HIV enfeksiyonu olan bir hastadaki viral tropizmi belirlemektir. Ardından, iç içe RT-PCR kullanılarak HIV GP120'nin V3 bölgesi amplifiye edilir. Daha sonra, jel elektroforezi kullanılarak ürünün varlığı tespit edilir ve ardından amplifiye edilen V3 ürünlerinin popülasyon tabanlı dizilemesi gerçekleştirilir.

Son olarak, sekansları baz çağırma (base calling) yazılımı kullanarak analiz edin ve genome-to-pheno algoritmasını kullanarak ko-reseptör kullanımını belirleyin. Nihayetinde bu sonuçlar, HIV-1 V3 loop'unun popülasyon tabanlı sekanslanması yoluyla, bir hastanın viral tropizminin R5 mi yoksa non-R5 mi olduğunu gösterebilir. Dolayısıyla, bu tropizm analiz tekniğinin fenotipik hücre tabanlı analizler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, sekanslama cihazına sahip herhangi bir laboratuvarda, daha düşük maliyetle, daha kısa sürede ve daha az başlangıç materyali ile gerçekleştirilebilmesidir.

Bu teknik, 500 µL plazmadan faydalanarak bir hastanın viral popülasyonunun bir CCR5 antagonistine yanıt verme olasılığının belirlenebilmesi nedeniyle antiretroviral terapi tedavisi ile ilgilidir. HIV RNA'yı ekstrakte etmek için EasyMag otomatik ekstraktör kullanın. Viral popülasyonun yeterli örneklemesini sağlamak amacıyla RT-PCR kurulumunu gerçekleştirmek için bir PCR temiz odasına geçin.

Bu tek aşamalı reaksiyonda, her bir ters transkripsiyon reaksiyonunu üç paralel (triplikatta) gerçekleştirmeyi planlayın. cDNA sentezlemek için viral RNA kullanın ve özellikle SQV three F1 ve CO 6 0 2 prime repair ile HIVV three bölgesini amplifiye edin. Reaksiyon başına bileşenleri temel alın.

Tekrarlayıcı pipet kullanarak, amplifiye edilecek örnek sayısına yetecek miktarda bir stok karışım çözeltisi hazırlayın. PCR plakası kuyucuklarının her birine 36 µL örnek karışımı ekleyin. Ardından, belirlenmiş kuyucukların her birine µL cinsinden RNA örnek ekstraktı aktarmak için çok kanallı pipete geçin. Her ekleme arasında uçları değiştirmeye özen gösterin.

Transfer işlemi tamamlandığında, kuyucukların üzerini PCR şerit kapaklarla kapatın. Ardından, PCR plakasını HIVV üç bölgesinin tek basamaklı R-T-P-C-R işlemi için programlanmış bir termosikletöre yerleştirin. Nested PCR için SQV üç F iki ve CD dört R primer çiftini kullanın.

Bir PCR temiz odasında amplifiye edilecek örnek sayısı için gerekli reaktif miktarını hesaplayın. İç içe (nested) PCR karışımını hazırlayın ve ardından bir tekrarlayıcı pipet kullanarak temiz bir PCR plakasının her kuyucuğuna 19 µL paylaştırın. R-T-P-C-R işlemi tamamlandığında, amplifikasyon sonrası odaya geçin.

R-T-P-C-R kalıbının bir mikrolitresini nested PCR karışımına aktarmak için sekiz kanallı çok kanallı bir pipet kullanın. Her ekleme arasında uçları değiştirin. Kuyucukların üzerini PCR strip kapaklarla kapatın ve amplifikasyon için plakayı bir termosikletere aktarın.

Sıcaklık 25 °C'ye döndükten sonra plakayı termosiklerden çıkarın. V3 bölgesinin başarıyla amplifiye edildiğini doğrulamak için öncelikle ürünleri jel elektroforezi ile analiz edin. Cyber safe jel boyası içeren %1,6'lık bir agaroz jel hazırlayın.

10 µL'lik çok kanallı bir pipet kullanarak, 8 µL'lik PCR örneklerini ilgili kuyucuklara aktarın. Ayrıca, her satırdaki en az bir kuyucuğa DNA merdiveni yükleyin.

Jeli yaklaşık 100 volt değerinde 10 dakika boyunca çalıştırın. Bantları ultraviyole floresans ile görüntüleyin ve görüntüyü fotoğraf çekerek belgeleyin. Tüm triplike amplifikasyonların başarılı olduğu örnekleri not edin.

Gerekirse, üçten az ürün amplifikasyonu olan örnekler için R-T-P-C-R işlemini tekrarlayın. Amplifiye edilen viral CDNA örnekleri, V 3 0 2 F ve S QV three R one primerleri kullanılarak gerçekleştirilecek DNA dizileme reaksiyonları ile daha fazla doğrulanacaktır. Big di reaktifini dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında çözdürün.

Çalıştırılacak örnek sayısına göre gerekli reaktifleri hesaplayın ve hazırlayın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, uygun plaka kuyucuklarına beş µL sekanslama reaksiyon karışımı ekleyin. Plakayı bir Kim wipe ile örtün ve kenara ayırın.

Bu sırada, kalan PCR ürününe 180 µL steril su ekleyerek amplifiye edilmiş PCR ürününün 1/15'lik dilüsyonunu hazırlayın. Seyreltilmiş numuneden 1 µL'yi uygun plaka kuyucuklarının dibine pipetleyin. Numune transferi tamamlandığında, numuneler arasında her zaman uç değiştirin.

Plakayı şerit kapaklarla kapatın ve bir saniye boyunca vorteksleyin. Plakayı santrifüj etmek için hızı 140 5G olarak ayarlayın. Dönüş hızı 140 5G'ye ulaştığında, santrifüjü durdurun.

Reaksiyonun gerçekleşmesi için plakayı bir termosikletöre yerleştirin. Her kuyucuğa DNA'yı çöktürmek için dört µL 3 M sodyum asetat ve 40 µL soğutulmuş %95 Ethanol ekleyin, ardından kapakları tekrar kapatın. Plakayı 10 saniye boyunca vorteksleyin ve hava kabarcıklarını gidermek için plakaya hafifçe vurun.

Plakaları -20 °C'de 30 dakika ile iki saat arasında bekletin. DNA'yı 2000 ×g'de 20 dakika santrifüj ederek geri kazanın. Şerit kapaklarını çıkarın ve atın.

Plakayı atık kabının üzerine ters çevirin ve süpernatantı dökün. Ters çevrilmiş plakaları bir kağıt havluya bastırarak kalan süpernatantı tamamen temizleyin.

Plakayı araya almak için iki kat kağıt havlu katlayın. Plaka yüzü aşağıya gelecek şekilde santrifüje yerleştirin ve 140 5G'de döndürün. Dönme işlemini 140 5G'ye ulaştığında durdurun.

Ardından 155 µL %95 etanol ile yıkayın ve üst fazı dökün. Sonra santrifüj işlemini tekrarlayın. Kalan etanolün tamamen buharlaşması için plağı iki ila beş dakika boyunca bekletin.

DNA örneklerini denatüre etmek için, boş olanlar da dahil olmak üzere plaktaki tüm kuyucuklara çok kanallı bir pipet kullanarak 10 µL high dye for maide dağıtın. Plağı bir septa ile kapatın ve iki dakika boyunca 90 °C'de bir termosikletöre yerleştirin. Son olarak, örnek plağını bir sekanslama plağına ve ardından sekanslayıcıya yerleştirin.

Veri analizi için kabul edilebilir bir yöntem, insan müdahalesi olmadan otomatik baz çağırma işlemi gerçekleştirmek amacıyla Recall yazılımının kullanılmasıdır. Recall, ücretsiz ve özel bir baz çağırma yazılımıdır; sisteme giriş yapın ve gözat seçeneği ile yüklenecek örnek dosyaları seçin. Ham sekanslama veri dosyasını bulun ve 20 megabytes'a kadar yükleme yapın.

Ardından, referans diziyi V three olarak ayarlayın. Verileri işle (process data) seçeneğine tıklayın. Örnek listesini görüntülemek için sayfanın sağ tarafındaki sonuç klasörünü seçin.

Kırmızı olanlar başarısız olmuştur. Yeşil olanlar ise başarılı olmuştur. Belirli bir örneğe ve görüntüle düğmesine tıklayarak sekansı inceleyebilir, sekans içerisinde gezinmek için sayfanın sağ tarafındaki talimatları takip edebilir ve dosyaları bir zip klasörü olarak indirebilirsiniz.

Viral tropizm, geno to pheno ko-reseptör algoritması kullanılarak popülasyon tabanlı sekanslama ile elde edilen dizilerden çıkarılabilir. Önemli ayarlar açılır menüsünden, motivate %2 ve %5.75 FPR klinik veri analizine göre optimize edilmiş olanı seçin. Şimdi analiz için bir dizi yüklemeyi veya yapıştırmayı seçin.

FASTA dosyaları kabul edilmektedir. CCR5 antagonistlerine karşı yanıt verme durumunun geno Tono FPRA öngörücüsünü elde etmek için başka işlemler eklemeyin. Oluşturulan G2P raporu, amino asit cinsinden V3 loop sekansını sağlar ve R5 kullanmayan virüslerle ilişkili mutasyonların ilgili konumlarını belirtir.

Raporun altında, yalancı pozitiflik oranı verilmiş ve bir CCR five antagonistine verilen yanıt açısından yorumlanmıştır. Bu rapor PDF dosyası olarak indirilebilir. Bir örnekten alınan üç sekanstan herhangi birinin R five olmadığı sonucuna varılırsa, hastanın bir CCR five antagonistine beklenen yanıtı vermesi olası değildir; HIV one V three loop'un RTP CR amplifikasyonlarının jel elektroforezi, tüm klinik örneklerin ürün oluşturmadığını göstermektedir.

Amplifiye edilen örneklerden elde edilen diziler, recall tarafından okunan bir kromatogramda görselleştirilebilir. Az sayıda karışımın olduğu temiz bir dizi beklenir. Diziler bazen karmaşık olabilir ve doğru baz atamasına uygun olmayabilir.

Bazı hastaların, burada gösterildiği gibi CCR5 kullanan virüs taşımadığının tespit edilmesi mümkündür. Bu hastaların CCR5 antagonist tedavisine yanıt verme olasılığı düşüktür. Ancak, G2P analiz raporunun altındaki yeşil kutuda belirtildiği üzere, hastaların çoğunluğunun CCR5 kullanan virüslerden oluşan bir viral popülasyona sahip olduğu görülmektedir.

Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, başlangıçtan sona yaklaşık dört günde uygulanabilir. Bu süre, ekstraksiyondan analize kadar olan süreci kapsar. Bu videoyu izledikten sonra, genome pheno biyoinformatik algoritması ile birlikte popülasyon tabanlı sekanslama yöntemlerini kullanarak viral tropizmin nasıl öngörüleceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

Pekala, her şey bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.