Bir Kısıtlama Enzim Temelli Klonlama Yöntemi değerlendirin

Bu prosedürün genel amacı, gag sekans polimorfizmlerinin in vitro HIV1 replikasyon kapasitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için, alt tip-C HIV1 enfekte bireylerden türetilen gag genlerini replikasyon yeteneğine sahip bir HIV1 plazmidine dahil etmektir. Bu işlem, öncelikle hastanın plazmasından gag geninin amplifiye edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, hastadan türetilen gag sekansının replikasyon yeteneğine sahip enfeksiyöz moleküler klon MJ-four içerisine klonlanmasıdır. Ardından, enfeksiyöz viral stoklar oluşturmak için gag-MJ-four kimera plazmidi transfekte edilir ve bir indikatör hücre hattı üzerindeki enfektiviteyi değerlendirmek için titresi belirlenir. Son adım, GXR-25 T-hücre hattında in vitro replikasyon kapasitesini ölçmektir. Nihayetinde, viral replikasyon kinetiğini görselleştirmek amacıyla, zaman içindeki virion üretimini nicelleştirmek için radyoaktif işaretli bir ters transkriptaz analizi kullanılır.

Bugün açıklayacağımız yöntem, HIV alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bunlar arasında HIV replikasyon uygunluğunun belirleyicilerinin tanımlanması ve HIV uygunluğunun uzun vadeli patogenezi nasıl etkilediğinin anlaşılması yer almaktadır. Yöntemleri bugün, lisansüstü öğrencilerimden ikisi olan Jessica Prince ve Dan Claiborne anlatacak.

Bu prosedüre başlamak için, tek aşamalı bir RT-PCR ile ters transkriptaz ve termostabil bir DNA polimeraz kullanarak RNA'dan cDNA'ya ters transkripsiyon yapın ve ilk tur DNA ürünlerini amplifiye edin. Ardından, ilk tur PCR amplifikasyonundan 1 µL'yi DNA şablonu olarak kullanarak, iç içe (nested) ikinci tur bir PCR amplifikasyonu gerçekleştirin. Sonrasında, ikinci tur reaksiyon hacminin 5 µL'sine 3 µL 5X yükleme boyası ekleyin.

Bantlar ayrılana kadar, UV floresan DNA boyası içeren %1'lik agaroz TAE jelinde 120 volt değerinde çalıştırın. Ardından, 1.6 KB bantları mavi ışık illuminatöründe görselleştirin. Bundan sonra, kalan 45 µL reaksiyon hacmini DNA boyası içeren %1'lik agaroz TAE jelinde çalıştırın. Uygun bantları temiz bir jiletle kesin ve birey başına üç pozitif reaksiyonu birleştirin. Ardından, bir jel saflaştırma kiti kullanarak jel diliminden DNA'yı ekstrakte edin ve nükleaz içermeyen su ile elüe edin. Ürünü, daha sonra kullanmak üzere -20 °C'de dondurun. 0:15:56 Bu prosedürde, MJ-four plazmidinin uzun terminal tekrar (LTR) 5' UTR bölgesini amplifiye ettikten sonra, 1.3 KB PCR ürünlerini illuminatörde görselleştirin. Pozitif amplikonları kesin, ardından daha önce açıklandığı gibi saflaştırın ve dondurun. Sonra, splice overlap extension PCR yoluyla füzyon MJ-four LTR gag amplikonlarını oluşturun. 3.2 kb uzunluğundaki amplikonu görselleştirin, kesin, saflaştırın ve dondurun. Şimdi, 1.5 µg MJ-four plazmidini ve 1.5 µg saflaştırılmış LTR-gag PCR ürününü, BCL-one restriksiyon endonükleazı ile 50 °C'de 1.5 saat boyunca digeste edin. Ardından, digestiyon reaksiyonuna 1 µL NGOM-four ekleyin ve 37 °C'de bir saat inkübe edin. Bundan sonra, restriksiyon digestiyon reaksiyonlarına 5x yükleme boyası ekleyin. Toplam hacmi, DNA boyası içeren %1'lik agaroz TAE jelinde 100 volt değerinde bir ila iki saat boyunca yavaşça elektroforez yapın. Klonlama için belirtilen bantları, daha önce açıklandığı gibi görselleştirin, kesin ve saflaştırın.

Ardından, saflaştırılmış LTR-gag inserti ile MJ-four vektör DNA'sını üçe bir insert-vektör oranında kullanarak ligasyon reaksiyonlarını hazırlayın. Ligasyon reaksiyonlarını dört °C'de gece boyunca inkübe edin.

Ardından, ligasyon ürünlerini mililitre başına 100 µg Ampisilin içeren LB agar plaklarına yayarak kimyasal olarak kompetan JM-109 bakterilerini transforme edin. Transforme edilmiş bakterileri 30 °C'de en az 22 saat boyunca büyütün. Klonlama doğruluğunu teyit etmek için, mini prep DNA'yı NGOM-four ve HPA-one restriksiyon enzimleri ile 37 °C'de iki saat boyunca çift sindirime tabi tutarak kesin.

Ardından, %1'lik agaroz TAE jelinde analiz edin. 0,05 enfeksiyon çokluğu ile 5×10⁵ GXR-25 hücresini enfekte etmek için, TZM-BL hücre deneyi ile belirlenen mikrolitre başına IU titresi bazında her bir stoktan gereken virüs hacmini hesaplayın. Tam önlük, yüz maskesi ve çift eldiven dahil olmak üzere, replikasyon yeteneği olan HIV ile çalışmak için uygun kişisel koruyucu ekipman kullandığınızdan emin olun. Enfeksiyon gününde, virüs stoklarını -80 °C dondurucudan çıkarın ve çözdürün. Daha sonra, 0,05 MOI değerine ulaşmak için virüsü C-R-P-M-I besiyerinde 100 µL hacme seyreltin. Bunu, her replikasyon deney seti içerisinde hem pozitif hem de negatif kontrol olacak şekilde V-tabanlı doku kültürüle işlenmiş 96 kuyucuklu plakaya ekleyin ve kuyucuklar arası çapraz kontaminasyonu sınırlamak için her iki sütundan birinin boş kalacağı şekilde plağı düzenleyin. Ardından, otomatik bir hücre sayıcı kullanarak GXR-25 hücrelerini sayın ve tüm enfeksiyonlar için toplamda gereken hücre sayısını hesaplayın. Gerekli hacmi 50 mL'lik konik bir tüpe paylaştırın ve hücreleri çöktürmek için santrifüjleyin. Daha sonra besiyerini dikkatlice aspire edin ve 100 µL başına 5×10⁵ hücre konsantrasyonunda C-R-P-M-I içerisinde yeniden süspanse edin. Hücreleri steril bir hazneye pipetleyin ve iyice karıştırın. Ardından çok kanallı bir pipet kullanarak, seyreltilmiş virüs içeren 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 100 µL hücre ekleyin ve iyice karıştırın. Bundan sonra, her kuyucuğa 2 µL 5 mg/mL'lik polibren çözeltisi ekleyin ve hücreleri iyice karıştırın. Ardından %5 CO2 içeren bir doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin.

Enfekte hücreleri yıkamak için, hücrelerin çöktürülmesini sağlamak amacıyla 96 kuyucuklu V tabanlı plakayı santrifüjleyin. Ardından, hücre peletini bozmadan ortamdan dikkatlice 150 µL sıvı alın ve yerine taze 150 µL C-R-P-M-I ekleyin. Hücreleri yeterince yıkamak için bu işlemi iki kez daha tekrarlayın. Son santrifüjden ve 150 µL C-R-P-M-I eklemesinden sonra, hücre peletini çok kanallı bir pipetle yeniden süspande edin. Her kuyucuktaki karışımı, 24 kuyucuklu bir doku kültürü plağının kuyucuğundaki 800 µL C-R-P-M-I içerisine ekleyin. Ardından plağı, 37 °C'deki %5CO2'li bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Her iki günde bir, kültür kuyucuğunun yüzeyinden 100 µL süpernatan alarak 96 kuyucuklu U tabanlı bir plağın kuyucuğuna aktarın ve RT analizi ile yapılacak sonraki incelemeler için dondurun. Daha sonra, hücreleri iyice yeniden süspande edin ve hücrelerin aşırı büyümesini önlemek için kalan hacmin yarısını uzaklaştırın. Ardından, her kuyucuğa 550 µL taze C-R-P-M-I ekleyerek orijinal hacmi geri kazandırın.

Bu prosedürde, RT ana karışımının her 1 mL'lik alikotuna 10 mCi/mL DTTP'den bir ila iki µL ve 1 M DTT'den dört µL ekleyin. RT ana karışımı, DTT ve DTTP içeren her bir 1,5 mL'lik mikro santrifüj tüpünü 1000 µL'lik bir pipetle dikkatlice karıştırın ve steril bir hazneye aktarın.

Ardından, 96 kuyucuklu ince duvarlı bir PCR plakasına her kuyucuğa 25 µL işaretli RT karışımı dağıtın. RT master mix içeren PCR plakasına her bir süpernatanttan 5 µL ekleyin. Daha sonra PCR plakasını yapışkan folyo kapakla kapatın ve bir termosikletörde 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, 200 µL çok kanallı pipet kullanarak folyo kapakta küçük delikler açın. Örnekleri beş kez karıştırın. Her bir örnekten 5 µL'yi DE-81 kağıdına aktarın ve tüm örneklerin 10 dakika boyunca havada kurumasına izin verin. Blotları ayrı yıkama kaplarına yerleştirin. Ardından blotları 1X SSC ile beş kez yıkayın. Daha sonra, havada kurumaya bırakmadan önce her yıkama için beş dakika boyunca %90 etanol ile iki kez yıkayın. Kuruduktan sonra, blotu dikkatlice Saran wrap ile sarın ve oda sıcaklığında, sıkıca kapatılmış bir kaset içinde gece boyunca fosfor ekrana maruz bırakın.

Hazır olduğunda, fosfor ekranları bir fosfor görüntüleyici ile analiz edin ve radyoaktif transkriptleri nicelendirin.

Gösterilmiştir. Burada, MJ-four plazmit omurgasına klonlanabilir hasta kaynaklı bir gag amplikonu oluşturmak için gerekli olan çeşitli PCR amplikonlarının elektroforetik ayrımını betimleyen temsili jel görüntüleri yer almaktadır. Bu temsili jel görüntüsü, hasta gag genlerinin MJ four'a klonlanması için gerçekleştirilen restriksiyon sindirimlerinin elektroforetik ayrımını betimlemektedir.

Bu temsili jel görüntüsü, saflaştırılmış bir gag MJ-dört kimera plazmit DNA'sının restriksiyon sindirimlerinin elektroforetik ayrımını göstermektedir. Bu grafik, GXR-25 hücre hattında replikasyon analizinin zaman içindeki tekrarlanabilirliğini göstermektedir. Yaklaşık bir yıl arayla gerçekleştirilen iki bağımsız deneyde GXR-25 hücrelerini enfekte etmek için aynı gag MJ dört kimera virüsleri kullanılmıştır.

Replikasyon skorları, logaritmik olarak dönüştürülmüş DLU değerlerinin eğimi hesaplanarak ve bu eğimin vahşi tip MJ-four'a normalize edilmesiyle oluşturulmuştur. İki bağımsız ölçüm güçlü bir korelasyon göstermekte olup, farklı zamanlarda ve farklı pasajdaki hücrelerle gerçekleştirilen analizlerin tekrarlanabilirliğini vurgulamaktadır. Bu teknik, HIV AIDS alanındaki araştırmacıların, dünya çapında en yaygın alt tip olan akut alt tip C enfeksiyonunda patogenezin viral belirleyicilerini keşfetmelerinin önünü açmıştır. Replikasyon yeteneği olan HIV ile çalışmak son derece tehlikeli olabilir. Canlı virüs içeren tüm adımlar, BSL iki artı tesisinde gerçekleştirilmelidir. Tüm yüzeyler düzenli olarak dekontamine edilmeli ve her zaman çift eldiven giyilmelidir.