Çok kanallı mikroakışkan Cihazlar ayırmak Boncuk ve Hücreler Dielectrophoresis ve Laminar Flow

Bu prosedürün genel amacı, baskılı devre kartları (PCB'ler) kullanılarak dielektroforez (DEP) yoluyla mikroakışkan cihazlar içerisindeki hücre ve boncukların manipüle edilmesidir. Bu işlem, öncelikle PCB elektrotlarının ve mikroakışkan kanalların tasarlanması ve hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise PCB mikroakışkan düzeneğinin ve boncuk ile hücre çözeltilerinin hazırlanmasıdır.

Prosedürün üçüncü adımı, kanalları düşük iletkenlikli besiyeri ile doldurmak, ardından boncukları ve hücreleri yüklemektir. Prosedürün son adımı, PCB düzeneğini güç amplifikatörü ve fonksiyon jeneratörüne bağlamak ve ardından DEP'i başlatmaktır. Nihayetinde, DEP kullanımı aracılığıyla mikroakışkan cihazlarda hücrelerin ve boncukların ayrıştırılmasını ve manipüle edilmesini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayabilirler çünkü istenen hücre veya boncuk manipülasyonu için mikroakışkan cihazla birlikte çalışan etkili bir elektrot geliştirebilmek adına, kullanıcının DEP prensiplerini anlamış olması gerekir. Öte yandan, elektrot olarak PCB'lerin kullanılması, mikroakışkan cihazlarda hücre ve boncuk aktivasyonunu çeşitli bilimsel disiplinler için erişilebilir hale getirir. Bu prosedürün ilk adımı, homojen olmayan bir elektrik alanı oluşturmak için istenen geometriye sahip baskı devre kartı veya PCB elektrotlarını tasarlamaktır.

Tasarım tamamlandığında, özelleştirilmiş PCB elektrot çiplerini ticari bir üretim tesisi aracılığıyla sipariş edin. Özel yapım PCB ulaştıktan sonra, bu gösterim için paketi açın ve ürünü inceleyin. PCB 8.4 santimetre uzunluğunda ve 2.1 santimetre genişliğindedir.

Metal elektrotlar beş milimetre genişliğindedir. Bu örnekte elektrotlar, iki uzun metal şeride ve elektrotların birbirinin içine geçtiği 4.5 milimetre uzunluğunda iki çapraz bölgeye sahiptir. Bu interdigite bölgeler, stimülatörden PCB elektroduna bir bağlantı oluşturmak için güçlü ve homojen olmayan bir elektrik alanı üretir.

Elektrodun ucuna 16 gauge bir tel yerleştirin. Teli PCB'nin metal alanında sabit tutmak için sıcak bir havya kullanın. Bu işlem teli ısıtır.

Lehimi ısıtılmış tele tutun ve küçük bir miktar lehimin telin içine akmasını sağlayın. Tel lehimle dolduktan sonra, lehim soğurken teli yerinde tutarak havya ile lehimleme aparatını kaldırın. PCB üzerindeki diğer elektriksel bağlantı için lehimleme işlemini tekrarlayın.

Bir sonraki adım, istenen dallanma paternine sahip mikroakışkan kanalları hazırlamaktır. Standart mikro fabrikasyon tekniklerini kullanarak, bir silikon gofret ve SU-8 fotoresist yardımıyla kanalları tanımlayan bir ana kalıp oluşturun. Bu ana kalıp, bir giriş kanalına ve üç hedef kanala sahiptir.

Kanalların genişliği 100 micrometers ve kanalların yüksekliği 27 micrometers'dır. Ana kalıp oluşturulduktan sonra, polymethyl LAANE veya PDMS elastomeri, 10:1 ağırlık oranında bir kürleme ajanı ile beş dakika boyunca karıştırın. Sıvı PDMS'i önceden hazırlanmış SU eight ana kalıbının üzerine dökün ve sıvı PDMS'i üç dakika boyunca vakuma maruz bırakarak hava kabarcıklarını giderin.

Tüm kabarcıkları tamamen gidermek için gerekirse vakum işlemini tekrarlayın. Gerekirse, fazla kabarcıkları gidermek için bir nitrojen gazı akımı kullanılabilir. PDMS'i bir fırında 70 °C'de iki saat boyunca kürleyin.

Mikroakışkan kanalları içeren P-D-M-S-S tabakasını gofretten ayırmak için bir jilet kullanın. Kanal boşluğu yukarı bakacak şekilde, gofreti kırmamaya dikkat edin. Mikroakışkan cihaza sıvı ve hücrelerin aktarılması için delikler açmak amacıyla bir biyopsi pansı kullanın. Kırpın.

Fazla PDMS'i temizleyin. Mikroakışkan cihazın toz ve kalıntılardan arındırıldığından emin olmak için cihazı kontrol edin. PDMS'i temizlemek için 3M Scotch Magic bant kullanın.

PDMS kanalları ve 80 ila 130 mikrometre kalınlığında temiz bir sıfır numaralı lamel ile 1,5 dakika boyunca plazma gazına maruz bırakın. PDMS tabakasını ve lameli plazma temizleyiciden çıkarıp bir Petri kabına alın, PDMS mikroakışkan kanallarını lamelin üzerine yerleştirin ve lamel-mikroakışkan düzeneğini 100 degrees Celsius'e ayarlanmış bir ısıtıcı tabla üzerinde en az 15 dakika boyunca ısıtın. Mikroakışkan cihazın hazırlanmasındaki son adım, PDMS kanalları ve lameli PCB'nin elektrotlarının üzerine konumlandırmaktır.

İşleme, PCB üzerine yaklaşık 10 µL mineral yağı damlatarak başlayın. PCB ile lam arasında sıkı bir temas sağlamak için, lamlı mikroakışkan kanal düzeneğini yağlanmış PCB'nin üzerine yerleştirin. Yağ ile temasa geçtiğinde, iyi bir temas sağlamak ve hücre ile boncukların görüntülenmesini engelleyebilecek hava kabarcıklarını en aza indirmek için lamlı mikroakışkan düzeneği nazikçe aşağıya doğru bastırın.

Bir diğer önemli adım, deiyonize su içerisinde ağırlık/hacim oranında %8,5 sükroz ve %0,3 glikoz içeren düşük iletkenlikli besiyeri karışımını hazırlamaktır. Mikroakışkan cihaz artık kullanıma hazırdır; bir pipet kullanarak her bir mikroakışkan kanalı, gerekirse 15 ila 20 µL düşük iletkenlikli besiyeri ile doldurun. Kanallardaki hava kabarcıklarını gidermek için vakum aspirasyonu uygulayın.

Bir sonraki adım, test partiküllerini mikroakışkan cihaza yerleştirmektir. Bu gösterimde, düşük iletkenlikli ortamda mikrolitre başına 550 polistiren boncuktan oluşan bir süspansiyon kullanılmaktadır; boncuklar zamanla çökelebileceğinden, karıştırarak boncukları yeniden süspande edin. Ardından, bir pipet kullanarak kanala 200 µL polistiren boncuk süspansiyonu ekleyin.

Bir sonraki adım elektrotları hazırlamak, bir fonksiyon jeneratörünün çıkışını bir AC güç amplifikatörünün girişine bağlamaktır. Ardından amplifikatörün çıkışını elektrot kablolarına bağlayın. Kullanıcıları olası elektrik şokuna maruz kalmaktan korumak için tüm elektrik kablolarını ve düzeneğin yüzeylerini elektrik bandı ile kaplayın.

Fonksiyon jeneratörünü 1 ila 1.5 megahertz arasında bir sinüs dalgası çıkışı üretecek şekilde ayarlayın. Bu düzendeki hücrelerin ve boncukların ayrıştırılmasını başlatmak için DEP'i başlatın. Giriş kanalı sağda yer almaktadır ve üç hedef kanal, üçlü kavşakta birbirinden ayrılır.

PCB elektrotları, laminer akış ve DEP olmayan siyah şeritlere karşılık gelmektedir. Boncuklar, akış yokken DEP başlatıldığında esas olarak durağandır. Laminer akış açık olduğunda, boncuklar PCB elektrotlarına doğru ve elektrotlar arasındaki boşluktan uzağa doğru göç eder.

Ancak DEP kapalıyken, giriş kanallarından akan boncuklar üç hedef kanal arasında bölünür. DEP başlatıldığında ve laminer akış açık olduğunda, boncuklar yalnızca merkez kanalda akacak şekilde yönlendirilir. Sonraki videolarda, mikroakışkan cihaz PCB elektrotlarının üzerinde döndürülmüş olup bu durum kanalların yöneliminde bir değişikliğe yol açmıştır.

PCB elektrotları açısından bakıldığında; daha önce PCB elektrotlarına dik olan Giriş kanalı, laminar akış açıkken artık elektrotlara neredeyse paraleldir. Ancak DEP kapalıyken boncuklar her üç hedef kanala eşit şekilde girer.

DEP başlatıldığında, boncuklar trifurkasyon noktasına yaklaşır ve DEP kuvveti boncukları elektrodun üzerindeki yan kanala çeker. Videodaki sonraki figür seti, mikroakışkan cihaz içindeki insan kolon adenokarsinomu veya HT 29 hücreleri ile floresan boncukların bir karışımını göstermektedir. Bu DIC görüntüsünde, açık ok laminer akış yönünü belirtmekte ve kanallar kesikli çizgilerle sınırlandırılmıştır.

Yansıtıcı metal elektrotlar açık renkli arka plan şeridi olarak görülebilir; boncukları görüntülemek için DIC mikroskobisi kullanılmıştır. Parlama. Ölçek yoğunluğu. Hücreleri daha görünür kılmak için görüntüler kullanılmıştır.

Bu şekil, hücrelerin yanı sıra boncukları da görselleştirebilmek için parlama ölçekli yoğunluk görüntüsü şeklinde sunulmuş olması dışında diğer şekille aynı görüntüdür. Yansıtıcı metal elektrotlar bu şekilde sarı ve yeşil şeritler olarak görünmektedir. DEP ile boncuklar, DIC görüntüsünde gösterildiği gibi sağ kanaldan çıkarken, HT 29 hücreleri DEP başlatılmadan önceki parlama ölçekli görüntüde gösterildiği gibi orta ve sol kanallardan çıkmaktadır. Hücre ve boncuklardan oluşan karma bir çözelti, tek bir giriş kanalından üç ayrı hedef kanala doğru akmaktadır.

DEP indüklendikten sonra, boncuklar ve hücreler seçici olarak ayrı kanallara yönlendirilir. Bu videoyu izledikten sonra, mikroakışkan cihazlar içerisinde hücrelerin ve boncukların manipülasyonu için diyal elektroforezin uygulanmasına nasıl başlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.