Birden Farklı Suşlarının incelenmesi için bir mikroakışkan Cihazı

Aşağıdaki yöntemin genel amacı, farklı maya suşlarından gelen tekil hücrelerin davranışlarını aynı dinamik koşullar altında görüntülemektir. Bu, iki katmanlı bir mikroakışkan cihaz üretilerek gerçekleştirilir; alt katman farklı suşların her birini ayrı ayrı içerecek, üst katman ise ikinci bir adım olarak dinamik akış koşullarını sağlayacaktır. Farklı maya suşları kuyucuklara yerleştirilir ve cihaz kapatılarak, birden fazla ayrılmış suşun bulunduğu tek bir kanal oluşturulur.

Ardından, dinamik ortam değişikliklerine karşı hücre yanıtlarını görüntülemeye geçiyoruz. Y Kanalının iki girişindeki akış hızları kontrol edilerek, farklı suşların aynı dinamik koşullara maruz bırakıldığı ve kuyucuklar arasında çapraz kontaminasyonun gerçekleşmediği görülmüştür. Bu mikroakışkan cihaz, mevcut diğer sistemlere göre birkaç temel avantaja sahiptir. Aynı dinamik koşullar altında birden fazla farklı suşun görüntülenmesine olanak tanır.

Ayrıca, önemli bir nokta olarak, özel bir ekipman gereksinimi olmaksızın herhangi bir laboratuvarda kolayca üretilebilir. Bu yöntem, farklı vahşi East izolatlarının açlık geçişlerine verdiği yanıtların nasıl takip edileceği konusundaki tartışmalardan doğmuştur. Başlangıç olarak, istenen mikrokanal düzenini ölçekli olarak çizin veya yazdırın.

Ardından, bir lamı scotch bant katmanlarıyla kaplayın. Kanalın istenen yüksekliğine ulaşmak için, yerleşim tasarımını düz bir yüzeye yerleştirin ve lamı tasarım deseniyle hizalayın. Şimdi, cam lam üzerindeki bandı yerleşime göre dikkatlice kesin. Scotch bandı cam lamın tüm bölgelerinden çıkarın.

Bunları mikro kanal düzenine uygun şekilde kabul edin. Lamı üç dakika boyunca 65 °C'lik bir ısıtma fırınında bekletin. Ardından etanol ile nazikçe temizleyin.

PDMS baz ve kürleme bileşenlerini üreticinin önerdiği şekilde karıştırın. Yaklaşık 30 mililitre PDMS karışımını, yaklaşık 0,5 santimetre yüksekliğe ulaşacak şekilde bir Petri kabına dökün. Gerekirse PDMS'i vakum altında gazdan arındırın.

Desenli scotch bant kısmı yukarı bakacak şekilde cam lamı PDMS'in içine daldırın. Deseni PDMS'ten sonra yerleştirmek, lam ile kap tabanı arasında hava kabarcığı oluşumunu önler. Yeni bir 90 milimetrelik Petri kabına üç mililitre PDMS karışımı dökün. Bir hava kabarcığı terazi kullanarak kabın yatay olduğundan emin olarak 65 degrees Celsius sıcaklıkta 48 saat boyunca kürleyin.

Bu adım, mevcutsa bir spin kodlayıcıda gerçekleştirilebilir. DGAs ve kürleme işlemleri daha önce gösterildiği gibi uygulanır. Şimdi, mikroakışkan cihazın akış katmanını bir biyopsi puncher'ı ile istenen boyutta dikkatlice kesin.

Akış katmanındaki giriş ve çıkışlar için delikler açın. Ayrıca, ikinci Petri kabından benzer boyutlarda bir kuyucuk katmanı kesin ve kalın bir cam üzerine yerleştirin. Tasarım düzenini üzerine kaydırın.

Ardından, etanol kullanarak yerleşim planındaki mikrokanallarla hizalı şekilde kuyucukları delin, her iki PDMS katmanını ve cam lamı temizleyin ve havada kurutun. Daha sonra, geri dönüşümsüz yapıştırma için standart bir plazma aşındırıcı veya geri dönüşümlü yapıştırma için el tipi bir korona işlemcisi ile cam lamı ve kuyucuk katmanı PDMS'i işlemden geçirin. Yapışmayı sağlamak için kuyucuk katmanını dikkatlice lamın üzerine yerleştirin.

Hava kabarcıkları nazikçe dışarı itilir. İstenen besiyeri uygun şırıngalarda hazırlanır ve bir şırınga pompası üzerinden geçirilen tigon hortumlarına bağlanır. Hücre görüntüleme için.

Güçleri kullanın. İstenen faza gidin, kültürü iyice vorteksleyin ve 300 microliters miktarını mikro santrifüj tüplerine aktarın. Her bir PDMS kuyu tabakası kuyucuğuna nazikçe bir microliters con canna A yerleştirin.

Con A kururken, her kuyucuktaki fazla con A'yı nazikçe su pipetleyerek iki kez yıkayın. Suşları, glikoz içermeyen 300 µL SC ortamı ile iki kez yıkayın. Hücre duvarlarındaki kalıntı glikozun yıkanması, konvalla doğru yapışmaya yardımcı olur.

Vortekslendikten sonra, hücre süspansiyonundan yaklaşık 0.5 µL hücreyi münferit kuyucuklara pipetle aktarın. Kalan hücreleri zengin besiyeri ile nazikçe yıkayın. Hücrelerin kurumasını önlemek için sonraki iki adımın hızlıca gerçekleştirilmesi gerekmektedir.

Opsiyonel bir adım olarak, kuyucuklara doğrudan çarpmamaya dikkat ederek çipi ve kuyucukları plazma ile işlemden geçirin. Ardından, bir stereoskop altında, ikisi arasındaki hizalamaya çok dikkat ederek çipi dikkatlice kuyucukların üzerine yerleştirin. İki PDMS katmanının birbirine yapışması için hafifçe bastırın.

Kanal içerisinde hava kabarcığı kalmadığından emin olarak, cihazı yaklaşık 50 µL zengin besiyerı ile yavaşça tamamen doldurun. Şimdi, tüpleri uygun girişlere yerleştirerek cihazı bağlayın ve besiyeri akışını başlatın. Borularda hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin; çünkü bu kabarcıklar cihazda takılıp akışı bozabilir.

Cihazı mikroskobun altına yerleştirin ve her birindeki uygun görüntüleme noktalarını bulun. Hücrelerin toparlanmasına izin vermek için, onları bir saat veya gerekirse daha uzun süre zengin besiyeri akışında tutun.

Deneye sabit akış ayarıyla başlayın. Pompa A'yı 0.8 milliliters per hour ve pompa B'yi 0.2 milliliters per hour değerine ayarlayın. Besiyeri, kanal genişliğinin %80'inden fazlasını kapsayacak şekilde akmalıdır.

Bağıl akış hızlarını değiştirerek cihazdaki koşulları dinamik olarak değiştirebiliriz. Yeni koşullar, tüm kanal boyunca saniyeler içinde stabilize olur. Farklı suşlar arasındaki ayrımı göstermek için, ayırt edilebilen iki maya suşu ardışık kuyucuklarda görüntülenir.

Bu deneyde kuyucuklar arasında hücre sızıntısı olmadığını unutmayın. Dinamik olarak değişen koşulların eş zamanlı etkisini test etmek için her iki suşta da MSN two transkripsiyon faktörü YFP ile etiketlenmiştir. Glukoz içermeyen ortamdan oluşan bir basamak oluşturmak amacıyla iki giriş kanalındaki akış hızları değiştirilmiştir.

Bu durum, MSN iki'nin çekirdeğe yerleşmesiyle sonuçlanmıştır. Önemli bir nokta olarak, tekil hücrelerdeki nükleer MSN iki YFP seviyelerinin zaman takibi analiz edilebilir. Böylece PDMS mikroakışkan cihaz, birden fazla kuyucuğa eş zamanlı dinamik koşullar uygulamak için kullanılabilir.

Bu prosedür uygulanırken, cihaz montajı sırasında hücrelerin kurumasına izin verilmemesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, yumuşak litografi ihtiyacı olmadan kolayca gerçekleştirilebilir.