Kraniofasial Geliştirme sırasında Ektodermal Epiteli Sinyal Özellikleri değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, donör embriyolardan alınan ektodermin civciv embriyolarının gelişmekte olan üst çenesine nakledilmesiyle kimera embriyolar oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle nakil için donör dermin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, konakçı bölge greftleme işlemi için hazırlanır.

Prosedürün son adımı, donör dokunun konak bölgeye yerleştirilmesi ve greftin konumuna sabitlenmesidir. Nihayetinde, yalnızca donör ektoderminin tutunduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir ve moleküler ile morfolojik analizler yoluyla, donör yeniden kodlanmış dermisin işlevi belirlenebilir. Bu yöntem, morfojenez sırasında çeşitli dokuların rolünün tanımlanması gibi gelişimsel biyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Prosedür, laboratuvarımızdan kıdemli bir araştırmacı olan Dr. Diane tarafından gösterilecektir. Bu prosedüre başlamadan önce, besiyerlerini hazırlayın ve gerekli tüm çözeltilerin erişilebilir ve doğru sıcaklıkta olduğundan emin olun. Ardından, uygun göz koruyucu ekipman takarken, mikro kılcal tüpleri bir alkol alevi üzerinde ince bir uç oluşturacak şekilde çekin.

Propan pürmüzü alevinde tutarak tungsten iğneleri keskinleştirmek için cam pinler hazırlayın. Yumurtanın ucuna bir parça bant yapıştırarak donör embriyonun kabuktan çıkarılması işlemine başlayın. Ardından, bandın merkezinde küçük bir delik açmak için bir diseksiyon iğnesinin ucunu kullanın.

10 mililitrelik bir şırıngayı ve 18 gauge'lik bir hipodermik iğneyi deliğe yerleştirin ve yumurtadan bir mililitre albümin çekin. Ardından, bir diseksiyon iğnesi kullanarak kabuğun üst kısmında küçük bir delik açın. Bu deliği kapatmak için ikinci bir bant parçası yapıştırın.

İki çift pens kullanarak yumurtada dairesel bir açıklık oluşturun. Embriyoyu kavrayın ve yıkamak için buz gibi soğuk PBS içeren bir kaba yerleştirin. Embriyonun baş kısmı çıkarıldıktan sonra, embriyoyu oda sıcaklığında, serumsuz DMEM içeren bir doku kültürü kabına yerleştirin.

Pensle baş kısmını tutarak kabı diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Üst çeneyi ve lagonu başın geri kalanından kaba diseksiyonla ayırmak için yaylı makas kullanın. Ardından, keskin bir jilet takılı bıçak tutucu kullanarak frontal nazal çıkıntıyı üst çeneden kesin.

Fronton nazal prosesini, içinde yeterli miktarda PBS'de çözünmüş dispa bulunan 30 milimetrelik bir Petri kabına aktarmak için bir pipet kullanın ve 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyon süresi dolduğunda, dokuya zarar vermeden dispa çözeltisini aspire edin. Ardından dokuları %1BSA içeren DMEM ile tamamen örtün.

Sindirimi durdurmak için dokuyu yeni bir kültür kabına aktarın. Ardından, bir diseksiyon mikroskobu altında çalışarak, dokuyu köreltilmiş bir tungsten iğne ile tutarken sivri uçlu bir tungsten iğne kullanın.

Ektodermi, diğer dokulardan soyarak ayırın. Hazırlama işlemi tamamlandıktan sonra, greft dokuyu konakçı transplantasyona hazır olana kadar buz üzerinde BSA içeren DMEM içerisinde saklayın. Daha önce gösterilen yöntemi kullanarak, tavuk yumurtasında bir pencere açın.

Embriyo içeren yumurtayı iki çift pens kullanarak diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. IGN membranını ve amniyonu kavrayın ve konak embriyoyu açığa çıkarmak için nazikçe yırtarak bir delik oluşturun. Bir pensi sağ göze yerleştirip basınç uygularken başı sabit tutarak başı döndürün.

Grefti yerleştirmek için konakçı dermisini pens ve iğne kullanarak çıkarın. Hazırlanan greftlerin bulunduğu Petri kabına iki µL nötr kırmızı ekleyin. Grefti konakçıya aktarmak için cam pipet kullanın.

Grefti, çıkarılan ektodermin yerine gelecek şekilde konumlandırın. Greftleme işleminin ardından, grefti sabitlemek için dokunun her köşesine bir cam iğne yerleştirin. Pencereyi bantla sıkıca kapatın.

Embriyoyu, analiz için gerekli gelişim aşamasına gelene kadar inkübatöre geri yerleştirin; bu görüntü, anti Q-C-P-N-A bıldırcın spesifik antikoru ile boyanmış bir bıldırcın civciv URA dokusunu göstermektedir. Greftlenen doku iki ok arasında yer almaktadır. Burada, bir fare civciv kimera aynasından alınan dokuda QCPN boyanmasına dair herhangi bir kanıt yoktur. Yine, greftlenen doku iki ok arasında yer almaktadır; C'de, sign B iki tekrarlayan dizisine özgü onaylanmış hibritleme işlemi gösterilmiştir.

Sınıf bir genlerin aynalanması, sign B iki ekspresyonunun, burada sülün civciv kimera aynasının görüntüsü olarak gösterilen grefti içeren bölgeyle sınırlı olduğunu ortaya koymaktadır; trikrom boyama, kolajen ve kemiği mavi renkte boyar. Üst çene iskeletinin duplikasyonu, okla belirtildiği üzere görülmektedir. Bu görüntü, yeniden trikrom boyama uygulanmış bir fare civciv kimera aynasını göstermektedir.

Üst çene iskeletinin duplikasyonu görülmektedir. Bu görüntü, burada gösterilen bir fare-civciv kimera dokusunda, raftlanmış civciv embriyosunun meşinkiminde normal BMP seven ekspresyonunun radyoaktif in situ hibridizasyonunu göstermektedir. Ok ile belirtildiği üzere, greftin bitişiğindeki meşinkimde BMP seven ekspresyonunun indüklendiği görülebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, ön ve burun çıkıntısının gelişimini düzenleyen mekanizmaları değerlendirmek için civciv embriyolarının nasıl manipüle edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.