Kranial mesenchyme Hücresel Davranış Değerlendirme için bir Eksplantasyon Assay

Bu prosedürün amacı, tanımlanmış kültür koşulları altında kranial meen chiming kültürünün davranışını izlemektir. İlk adım, zamanlanmış gebe bir fareden uterus boynuzlarının toplanmasıdır.

Çiftleşmeden 8,5 gün sonra. İzole edildikten sonra, embriyolar desidua tabakasından çıkarılır ve genotipleme için vitellus kesesi uzaklaştırılır. Ardından, kranial mechy yapıları mikrodiseksiyonla ayrılır ve hücre dışı matris kaplı doku kültürü plakalarına aktarılır.

X eksplantlarının yapışmasına izin verilir ve belirlenmiş farmakolojik ajanların varlığında veya yokluğunda 48 saate kadar kültüre edilirler. Nihayetinde, hücre göçündeki farklılıkları göstermek için eksplantların görüntüleri alınır. Bu yöntem, nöral katlanma yükselmesi sırasında kranial dokunun davranışını kontrol eden ve bu sürece dahil olan sinyal yolakları ve hücre dışı matris proteinlerinin neler olduğu gibi temel soruları yanıtlamak için faydalıdır.

Mikrodiseksiyon adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan ve ustalaşmak için sabır ve pratik gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşır. Başlamak için, eğer immünohistokimya yapılacaksa lamine lamlar hazırlayın; aksi takdirde bu adımı atlayın ve doku kültürü plakalarını doğrudan ECM ile kaplayın. 12 milimetrelik dairesel cam lamine lamları etanol içine daldırarak sterilize edin. Havada kurumalarını bekleyin. Ardından, 12 kuyucuklu bir plağın her bir kuyucuğuna sterilize edilmiş bir lamine lam yerleştirin.

Laminer akışlı kabin içerisinde, lamelleri veya doku kültürü plağının tabanını kaplamak için 1 mL hücre dışı matriks (ECM) ekleyin. Plağı 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından ECM çözeltisini aspire edin ve PBS ile üç kez yıkayın. Bu aşamadan sonra, kaplanmış plaklar hemen kullanılabilir veya streç filmle sarılarak 4 °C'de iki haftaya kadar saklanabilir.

Yarı saydam embriyonun görselleştirilmesinde Ade kullanılır. Üreticinin protokolü takip edilerek, dirençli siyah arka planlara sahip Syl guard plakaları hazırlanır.

Bir toplu iğneyi iğne tutucuya yerleştirerek diseksiyon aletlerini hazırlayın. Her şey hazır olduğunda, pensleri bilemek için bir bileme bloğu kullanın. Quot sonrası 8,5. günde olan, zamanlanmış gebe bir fareden uterus örneği toplayın.

İzole edilen uterusu steril PBS içeren bir kaba yerleştirin ve yıkayın. Diseksiyon mikroskobu altında, pens ve makas kullanarak bireysel desiduaları birbirinden ayırın. Embriyonun desiduadan çıkmasına neden olacak baskı oluşturmamaya dikkat ederek, uterine bağ dokusunu yırtma hareketiyle uzaklaştırın.

Pens yardımıyla, plasentanın karşı tarafındaki uterus dokusunu dikkatlice yırtın. Vitellus kesesi içindeki embriyoyu açığa çıkarmak için, pensle embriyoyu ve vitellus kesesini plasentadan koparın ve uterus dokusunu kaptan çıkarın. Ardından, pensle nazikçe yırtarak vitellus kesesini embriyodan ayırın.

İzole edilen vitellus kesesini, genotipleme için bir pipet yardımıyla eppendorf tüpüne yerleştirin; ardından somitleri sayarak embriyonun evresini belirleyin. İdeal olarak, embriyo altı ile on somit arasında, yani orta evrelerde olmalıdır. Bu evrede, nöral kıvrımlar yükselmeye yeni başlamıştır ve kranial mezenşimin ana morfogenezi henüz gerçekleşmemiştir.

Evre belirlendikten sonra, embriyoyu fenol kırmızısı içermeyen DMEM bulunan siyah bir hücre koruma plakasına aktarın. İlk olarak, mümkün olan en yüksek büyütmeye sahip bir diseksiyon mikroskobu altında, her iki elinizde bir diseksiyon iğnesiyle embriyonun başına odaklanın ve başı rmba sınırının anteriorundan diseke edin. Ardından, ikiye bölmek için orta hat boyunca kesin.

Her iki elinizde birer diseksiyon iğnesi kullanarak başı iki eşit yarıya ayırın. Embriyo başının kenarı ve orta hattı boyunca dış saçakları disseke edin. İstenen açıklamanın istenmeyen dokuyla karıştırılmasını önlemek için gerekli kısımları uzaklaştırın.

Eksplan; göç eden kranial nöral kristayı, paraksiyal mezodermi ve yüzey ektodermini içerecek, gevşekçe tutunmuş hücrelerin uzaklaştırılması sağlanacaktır. 200 µL'lik bir pipet ucu ile dikkatlice yukarı-aşağı pipetleme yapın. Eksplanı ise bir pipet ucu ile dikkatlice alın.

Kaplamalı bir doku kültürü kabının merkezine yaklaşık 10 µL DMEM yerleştirin ve üzerine %15 FBS ile desteklenmiş 20 µL ılık DMEM ekleyin; kültür kabı artık bir doku kültürü inkübatörüne aktarılabilir. Yaklaşık bir ila iki saat sonra eksplant yapışacaktır ve ek olarak 250 µL besiyeri eklenebilir. Yaklaşık 24 saat sonra, eksplant lamel üzerine sıkıca tutunmuş olacaktır.

Bu aşamada, ek 24 saatin ardından medyuma farmakolojik ajanlar eklenebilir, hücreler bunlardan göç edecektir. Göç eden hücrelerin sayısını ve mesafesini belgelemek için tipik olarak görüntüler alınır. Bu noktada, daha uzun inkübasyon sürelerinde canlılığın azaldığına dair belirtiler görülmeye başlar.

Kranial mezankim ve kıkırdak öncülü bitkilerinden göç eden hücrelere ilişkin örnekler burada sunulmuştur. Farklı substratlarda 48 saat sonra, eksplanttan göç eden hücrelerin hem şekli hem de boyutu substrata bağımlıdır. Substrat göçü; fibronectin, laminin, matrigel, ECM ve hyaluronik asit üzerinde desteklenmiştir.

Bu prosedürün ardından, nöral kıvrım yükselmesi sırasında kranial mezenkimin davranışını düzenleyen yolakları daha ayrıntılı incelemek için immünofloresan ve canlı görüntüleme gibi diğer yöntemler kullanılabilir.